本发明涉及的是一种分子印迹传感器的制备方法及快速检测应用技术领域，特别涉及一种纳米银/碳纳米管修饰电极柚皮苷分子印迹传感器的制备方法，用于检测药品、食品、生物样品中的柚皮苷。
背景技术：
柚皮苷（别名：柚苷、柑橘甙、异橙皮甙），其分子式为c27h32o14，相对分子质量为580.53，白色至浅黄色结晶性粉末，溶于甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀碱溶液和热水，常温下，在水中的溶解度为0.1%，75℃时可达10%。不溶于石油醚、乙醚、苯和氯仿等非极性溶剂。柚皮苷是一种双氢黄酮类化合物。由于a环和b环之间完全没有共轭，所以在282nm有强烈的紫外吸收峰，使柚皮苷显示多种生物学活性和药理作用。具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗突变、抗过敏、抗溃疡、镇痛、降血压活性，能降血胆固醇、减少血栓的形成，改善局部微循环和营养供给，可用于生产防治心脑血管疾病。柚皮甙有明显的抗炎作用，200mg/l浓度的柚皮甙对水疱性口炎病毒有很强的抑制作用；降低血液的粘滞度、减少血栓的形成,并且有镇痛、镇静以及较强的增加实验动物胆汁分泌；有脱敏和抗过敏、活血解痉、改善局部微循环和营养供给的性能，对促进药物排泄、解除链霉素对第8对脑神经的损害、缓解链霉素的毒副作用有独特疗效；柚皮甙在碱性条件下，经氧化处理，可得到二氢查耳酮甜味剂，其甜度是蔗糖的1000倍。柚皮甙与异香兰素作用，得新橙皮甙，新橙皮甙是二氢查耳酮甜度的950倍，是一种无毒、低能量、高甜度的新一代甜味剂。
目前，检测柚皮苷的方法主要有高效液相色谱、液相色谱-质谱，色谱法的准确度受到一定限制、而且仪器比较贵需要专业人员操作，也限制了其应用。另外，由于柚皮苷与其它黄酮类分子结构十分相近很难分开，测定时互相干扰，准确检测柚皮苷很困难。因此，找到一种选择性好、灵敏度高、操作简便用于的检测柚皮苷的方法具有重要使用价值。
分子印迹技术是当前开发具有分子识别功能的高选择性材料的主要方法之一，它是通过在模板分子周围形成一个高度交联的刚性高分子，除去模板分子后在分子印迹聚合物的网络结构中留下具有结合能力的识别位点，对模板分子表现出高选择识别性能的一种技术。这项技术以其构效预定性和特异识别性越来越受到人们的关注，已经成功用于固相萃取或微固相萃取，亲和色谱或毛细管电泳及传感器等领域。
依据此技术制备的分子印迹传感器，应用于药物分析、环境保护及生命科学研究中起着十分重要的作用。将功能分子以适当方式修饰到电极上，制备选择性好、灵敏度高、有一定使用寿命可再生的电化学传感器成为分析科学工作者努力探索的课题。但是传统的印迹方法所制备的印迹膜厚度难以控制，高交联度使得电子传递速度和响应慢、检测下限高，影响分子印迹技术在电化学传感器中的应用。因此，建立一种灵敏、快速、简便、特异性高、重复性好经济使用的检测方法，对食品、药品、生物样品中的柚皮苷含量准确定量测定十分必要。
技术实现要素：
本发明的目的是将分子印迹与电化学传感器相结合，提供了一种柚皮苷分子印迹电化学传感器的制备方法，主要是以柚皮苷为模板，在玻碳电极表面通过氧化碳纳米管、纳米银粒子的修饰，提高了传感器的灵敏度，采用滴涂法制制备柚皮苷分子印迹电化学传感器。
仪器与试剂
chi660b电化学工作站（上海辰华仪器公司），实验采用三电极体系：铂丝电极为辅助电极，ag/agcl为参比电极（sce），玻碳电极（gce）为工作电极；kq-250e型超声波清洗器（坤峰超声仪器有限公司）。
氧化碳纳米管；季戊四醇三丙烯酸酯(peta)、衣康酸；1-丙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐，偶氮二异丁腈，无水乙醇；柚皮苷；硝酸银；明胶；磷酸缓冲溶液；所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
本发明的目的通过如下技术方案实现。
一种纳米银/碳纳米管修饰电极柚皮苷分子印迹传感器的制备方法，特征在于，该方法具有以下工艺步骤：
（1）纳米银/碳纳米管修饰液制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，去离子水：78~84%，硝酸银：2.0~5.0%，氧化碳纳米管：3~8%，室温下超声20min，分散均匀，再加入质量百分浓度为20%水合肼：10~15%，各组分含量之和为百分之百，搅拌反应20min，放置过夜，得到纳米银/碳纳米管修饰液；
（2）纳米银/碳纳米管修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，在玻碳电极表面滴加15~18μl纳米金石墨烯修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/碳纳米管修饰电极；
（3）柚皮苷分子印迹聚合物的制备：在反应器中，按如下组成质量百分浓度加入，乙醇：52~62%，二季戊四醇三丙烯酸酯：8~15%，衣康酸：5~10%，1-丙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐：10~18%，偶氮二异丁腈：1.0~3.0%，柚皮苷：4.0~10%，各组分含量之和为百分之百，搅拌溶解，通惰性气体除氧15min，无氧氛围，60±2℃搅拌反应18~24h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为3:1混合溶液浸泡12~15h，除去模板分子，干燥，即得柚皮苷分子印迹聚合物；
（4）柚皮苷分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的柚皮苷分子印迹聚合物分散于1%的明胶溶液中，制得20g/l的柚皮苷分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15~20μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/碳纳米管修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得柚皮苷分子印迹电化学传感器。
在步骤（1）中所述的硝酸银与氧化碳纳米管的质量比为1：2~3最优。
在步骤（3）中所述的二季戊四醇三丙烯酸酯：衣康酸：1-丙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐的摩尔为1：1：1最优。
在步骤（3）中所述的惰性气体为氖气或氩气。
在步骤（3）中所述的无氧氛围为聚合反应过程一直通入惰性气体。
本发明的优点及效果是：
本发明将印迹技术、层层自组装法和滴涂法相结合，在纳米银/碳纳米管修饰玻碳电极表面成功地研制了一种具有特异选择性的柚皮苷印迹电化学传感器。通过与纳米银/碳纳米管修饰的分子印迹电极那个的响应进行比较，本发明制备的柚皮苷分子印迹传感器的响应大大提高。该印迹传感器对柚皮苷表现出较高的亲和性和选择性，响应电流与柚皮苷的浓度在1.0×10-7~2.0×10-4mol/l范围内呈良好的线性关系，检测限为2.16×10-8mol/l将本发明制备的柚皮苷分子印迹电化学传感器成功用于药品、食品、生物样品中柚皮苷的检测中，回收率在96.52~104.12%之间，因此本发明制备的柚皮苷分子印迹传感器可广泛应用于化工、生物医药、食品、环保检测等相关领域。
具体实施方式
实施例1
（1）纳米银/碳纳米管修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：8ml，硝酸银：0.3g，氧化碳纳米管：0.6g，室温下超声20min，分散均匀，20%水合肼：1.1ml，搅拌反应20min，放置过夜，得到纳米银/碳纳米管修饰液；
（2）纳米银/碳纳米管修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，在玻碳电极表面滴加16μl纳米金石墨烯修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/碳纳米管修饰电极；
（3）柚皮苷分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：72ml，二季戊四醇三丙烯酸酯：12g，衣康酸：8g，1-丙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐：14g，偶氮二异丁腈：2.0g，柚皮苷：7g，搅拌溶解，通惰性气体除氧15min，无氧氛围，60±2℃搅拌反应20h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为3:1混合溶液浸泡13h，除去模板分子，干燥，即得柚皮苷分子印迹聚合物；
（4）柚皮苷分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的柚皮苷分子印迹聚合物分散于1%的明胶溶液中，制得20g/l的柚皮苷分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液16μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/碳纳米管修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得柚皮苷分子印迹电化学传感器。
实施例2
（1）纳米银/碳纳米管修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：7.8ml，硝酸银：0.2g，氧化碳纳米管：0.5g，室温下超声20min，分散均匀，20%水合肼：1.5ml，搅拌反应20min，放置过夜，得到纳米银/碳纳米管修饰液；
（2）纳米银/碳纳米管修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，在玻碳电极表面滴加17μl纳米金石墨烯修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/碳纳米管修饰电极；
（3）柚皮苷分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：6.6ml，二季戊四醇三丙烯酸酯：1.5g，衣康酸：1.0g，1-丙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐：1.0g，偶氮二异丁腈：0.3g，柚皮苷：1.0g，搅拌溶解，通惰性气体除氧15min，无氧氛围，60±2℃搅拌反应18h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为3:1混合溶液浸泡12h，除去模板分子，干燥，即得柚皮苷分子印迹聚合物；
（4）柚皮苷分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的柚皮苷分子印迹聚合物分散于1%的明胶溶液中，制得20g/l的柚皮苷分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液17μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/碳纳米管修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得柚皮苷分子印迹电化学传感器。
实施例3
（1）纳米银/碳纳米管修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：8.4ml，硝酸银：0.3g，氧化碳纳米管：0.3g，室温下超声20min，分散均匀，20%水合肼：1.0ml，搅拌反应20min，放置过夜，得到纳米银/碳纳米管修饰液；
（2）纳米银/碳纳米管修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，在玻碳电极表面滴加15μl纳米金石墨烯修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/碳纳米管修饰电极；
（（3）柚皮苷分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：7.8ml，二季戊四醇三丙烯酸酯：0.8g，衣康酸：0.8g，1-丙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐：1.8g，偶氮二异丁腈：0.1g，柚皮苷：0.6g，搅拌溶解，通惰性气体除氧15min，无氧氛围，60±2℃搅拌反应24h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为3:1混合溶液浸泡14h，除去模板分子，干燥，即得柚皮苷分子印迹聚合物；
（4）柚皮苷分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的柚皮苷分子印迹聚合物分散于1%的明胶溶液中，制得20g/l的柚皮苷分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液20μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/碳纳米管修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得柚皮苷分子印迹电化学传感器。
实施例4
（1）纳米银/碳纳米管修饰液制备：在反应器中，分别加入，去离子水：8.2ml，硝酸银：0.2g，氧化碳纳米管：0.6g，室温下超声20min，分散均匀，20%水合肼：1.0ml，搅拌反应20min，放置过夜，得到纳米银/碳纳米管修饰液；
（2）纳米银/碳纳米管修饰电极制备：将玻碳电极依次用0.2μm、0.01μm抛光粉进行表面抛光，然后分别用二次蒸馏水超声清洗，乙醇洗涤，吹干，在玻碳电极表面滴加12μl纳米金石墨烯修饰液，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得纳米银/碳纳米管修饰电极；
（3）柚皮苷分子印迹聚合物的制备：在反应器中，分别加入，乙醇：7.6ml，二季戊四醇三丙烯酸酯：1.0g，衣康酸：0.7g，1-丙烯基-3-乙基咪唑六氟磷酸盐：1.7g，偶氮二异丁腈：0.2g，柚皮苷：0.4g，搅拌溶解，通惰性气体除氧15min，无氧氛围，60±2℃搅拌反应19h，将得到的产物用甲醇：乙酸体积比为3:1混合溶液浸泡15h，除去模板分子，干燥，即得柚皮苷分子印迹聚合物；
（4）柚皮苷分子印迹电化学传感器的制备方法：取适量的柚皮苷分子印迹聚合物分散于1%的明胶溶液中，制得20g/l的柚皮苷分子印迹聚合物溶液；然后将上述溶液15μl滴加到步骤（2）制备的纳米银/碳纳米管修饰电极，置于红外灯下，挥发干溶剂后，即得柚皮苷分子印迹电化学传感器。
实施例5
将上述实施例1~4所制备的柚皮苷分子印迹电化学传感器，用于柚皮苷的检测，步骤如下：
（1）标准溶液配制：配制一组包括空白标样在内的不同浓度的柚皮苷标准溶液，底液为ph7.2的磷酸盐缓冲溶液；
（2）工作曲线绘制：将ag/agcl为参比电极，铂丝电极为辅助电极，本发明制备的电极为工作电极组成三电极系统，连接chi660b电化学工作站，在k3[fe(cn)6]溶液中，采用循环伏安法在-0.20~1.0v电位范围内进行检测，空白标样的响应电流记为i0，含有不同浓度的柚皮苷标准溶液的响应电流即为ii，响应电流降低的差值为△i=i0-ii，△i与柚皮苷标准溶液的质量浓度c之间呈线性关系，绘制△i~c工作曲线；
（3）柚皮苷的检测：用待测样品代替步骤（1）中的柚皮苷标准溶液，按照步骤（2）的方法进行检测，根据响应电流降低的差值△i和工作曲线，得到待测样品中柚皮苷的含量；
所述k3[fe(cn)6]溶液的浓度为6.0mmol/l；
所述ph7.2的磷酸盐缓冲溶液的浓度在20mmol/l。