本发明涉及糖化血红蛋白含量检测
技术领域：
，尤其是一种测定糖化血红蛋白含量中化学发光板的包被方法。
背景技术：
：化学发光免疫分析是灵敏度较高的一种检测技术，其具有标记物稳定性好，无污染，操作简单等优点，该方法能够很好的弥补上述其他方法的不足。包被抗体的化学发光板是化学发光免疫分析检测试剂盒中重要的一部分，它是检测糖化血红蛋白含量的基体，对于该发光板包被的处理能够反应该检测试剂盒的性能指标。该检测试剂盒的性能指标的准确度和灵敏度等性能的好坏，对于血清中糖化血红蛋白含量的测定发挥重要的作用，能为临床诊断、监测治疗提供科学依据。技术实现要素：为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种测定糖化血红蛋白含量中化学发光板的包被方法，该化学发光板的包被方法能够准确地对血清中糖化血红蛋白的含量进行定量定性分析，该化学发光板的包被方法能够提升检测试剂盒的性能指标，使其具有较高的灵敏度，较宽的线性范围等特点。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种测定糖化血红蛋白含量中化学发光板的包被方法，其特征在于，包括以下步骤：①制备包被过程中的使用液，该使用液包括包被液、清洗液、复合酶液、偶联液、保护液，②选取材质为96孔白色不透明的聚苯乙烯微孔板，③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶联液，室温条件下孵育30min，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶联过程中温度条件为室温，时间为1h，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；⑤再在聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的保护液，低温，风干，所述包被液由40mm的ph＝7.4的磷酸盐缓冲液、4.5ug/ml的糖化血红蛋白抗体、质量分数为0.05％的brij-35、质量分数为1.5％的蔗糖、质量分数为0.05％的pc-300组成，所述4.5ug/ml的糖化血红蛋白抗体制备过程如下：选取糖化血红蛋白抗体，加入50微升复合酶液，酶切过程中温度条件为37℃，时间为1.5h，所述清洗液由40mm的ph＝7.4的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.05％的tween-80组成，所述复合酶液是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比例为1:1，所述偶联液采用1.5mm的n,n’-羰基二咪唑的醇溶液，所述保护液采用质量分数为50％的甘油-磷酸盐缓冲液。采用上述方案，本发明的发光板的包被方法对于某些干扰物有较好的抵抗能力，如类风湿因子等，其灵敏度高、简便快速、抗干扰能力强，在糖化血红蛋白含量的测定中发挥重要作用，能够为临床诊断、监测治疗提供科学依据。下面结合附图对本发明作进一步描述。附图说明附图1为本发明具体实施例6试剂方法与参考方法检测结果相关分析图，采用化学发光仪，对40个血清样本进行测定，并对其进行相关分析。其中相关系数：r2＝0.996，线性方程为：y＝1.008x-0.004。具体实施方式本发明的保护范围不局限于下述具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。本发明的具体实施例所采用的测定糖化血红蛋白含量中化学发光板的包被方法，其包括以下步骤：①制备包被过程中的使用液，该使用液包括包被液、清洗液、复合酶液、偶联液、保护液，包被液由40mm的ph＝7.4的磷酸盐缓冲液、4.5ug/ml的糖化血红蛋白抗体、质量分数为0.05％的brij-35、质量分数为1.5％的蔗糖、质量分数为0.05％的pc-300组成，4.5ug/ml的糖化血红蛋白抗体制备过程如下：选取糖化血红蛋白抗体，加入50微升复合酶液，酶切过程中温度条件为37℃，时间为1.5h，清洗液由40mm的ph＝7.4的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.05％的tween-80组成，复合酶液是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比例为1:1，偶联液采用1.5mm的n,n’-羰基二咪唑的醇溶液，保护液采用质量分数为50％的甘油-磷酸盐缓冲液。②选取材质为96孔白色不透明的聚苯乙烯微孔板，③聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的偶联液，室温条件下孵育30min，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；④聚苯乙烯微孔板的每孔再加入100微升的包被液，偶联过程中温度条件为室温，时间为1h，用清洗液清洗聚苯乙烯微孔板3次，每次5min；⑤再在聚苯乙烯微孔板的每孔加入50微升的保护液，低温，风干。具体实施例1自4℃冰箱中取出糖化血红蛋白的测定试剂盒，该试剂盒中包括有糖化血红蛋白抗体酶结合物、糖化血红蛋白抗体包被板、校准品、质控品、浓缩洗涤液、洗涤稀释液、发光底物a和发光底物b，糖化血红蛋白抗体酶结合物中糖化血红蛋白抗体浓度为2.5ug/ml，糖化血红蛋白抗体包被板为白色不透明的96孔聚苯乙烯塑料板，糖化血红蛋白标准品的校准品浓度分别为0ng/ml，50ng/ml，100ng/ml，200ng/ml，400ng/ml，糖化血红蛋白标准品的稀释液采用质量分数为0.9％的生理盐水，质控品包括糖化血红蛋白抗原、质量分数为0.1％的bsa、质量分数为0.9％的氯化钠、10mm的ph为7.4的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.05％的pc-300，浓缩洗涤溶液包括150mm的ph＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液、质量分数为0.05％pc-300，150mm的ph＝7.0～8.0的磷酸盐缓冲液中含有体积分数为0.1％的brij-35，洗涤稀释液采用由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾组成的磷酸盐缓冲液，发光底物a包括20mm的3-氨基邻苯二甲酰肼、15g/l的甘氨酸、5mm的硫酸镁的100mm碳酸钾，发光底物b包括体积分数为10％的过氧化氢、15mm的磷酸缓冲液。试剂盒取出后，室温平衡15分钟，然后按下表程序进行操作：糖化血红蛋白加样测定程序表单位：μl注：待测样品的浓度计算按下列方法进行：用化学发光分析仪中的数据处理程序(拟合类型：线性拟合，坐标选择：log(x)-log(y)，实验方法：夹心法。)直接给出校准曲线及样品的浓度值。该包被板的类风湿因子干扰试验：板一包被液中的抗体是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例为1:1处理过的；板二包被液中的抗体是由胃蛋白酶处理过的；板三包被液中的抗体是由木瓜蛋白酶处理过的；板四包被液中的抗体是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例为0.5:0.3处理过的；板五包被液中的抗体是由胃蛋白酶和木瓜蛋白酶按照二者的比例为0.5:0.5处理过的；同体积的混合血清分别加入不同浓度的类风湿因子，如40u/l，100u/l，120u/l；检测结果如下表。名称40(u/l)100(u/l)120(u/l)板一39.5100.3119.9板二35.1103.5100.7板三35.9105.199.8板四31.9107.9129.6板五32.9104.1121.2通过试验结果综合比较表明，板一的实际浓度与理论浓度的差异较小，并且在测定类风湿因子小于120u/l时无干扰。具体实施例2通过上述实例1的结果，选择包被板一继续检测该包被板的溶血干扰，脂血干扰，胆红素干扰试验：将15mg/l的血红蛋白(hb)配制成不同浓度的血红蛋白(hb)，分别加入同体积的无溶血血清中，检测其糖化血红蛋白的含量；将一定浓度的脂肪乳取不同体积加入到相同体积的混合血清中，检测其糖化血红蛋白的含量；将一定浓度的胆红素取不同体积加入到相同体积的混合血清中，检测其糖化血红蛋白的含量；检测结果如下表。通过试验结果综合比较表明，加入不同浓度干扰物情况下，检测目的物质实际浓度与理论浓度的差异比较，当血红蛋白(hb)浓度小于15mg/l，甘油三酯(tg)浓度小于3.00ug/ml，胆红素浓度小于5.00ug/ml对糖化血红蛋白的含量检测无干扰。具体实施例3精密度的检测：对化学发光板的批内精密度和批间精密度的进行测定，结果如下所示，批内精密度：对某一血清样本测定10次，对下述数据计算，批内精密度差异结果为0.82％，测得差异较小。批间精密度：选取3个不同批次的发光板，分别对某一血清样本测定10次，结果如下表格所示，分别算出3批浓度的差异结果为2.20％，1.66％，0.62％；3个3个不同批次的发光板相比较，差异变化较小。具体实施例4包被液中抗体酶切条件的筛选：由于类风湿因子容易与抗体结合，对目的物的测定结果产生较多干扰，利用酶切抗体的方式，增强该板的抗干扰能力，对糖化血红蛋白的含量进行测定，酶切条件和结果如下表：综合上述试验结果表明：酶切条件在37℃，时间为1.5h时，理论浓度与实际浓度差异最小。具体实施例5包被过程中偶联条件的筛选：由于抗体在结合过程中的结合速度受时间和温度条件影响较大，为了使操作简便，提升包被效率，对糖化血红蛋白的含量进行测定，偶联条件和结果如下表：综合上述试验结果表明：偶联条件在室温，时间为1h时，理论浓度与实际浓度差异最小。具体实施例6相关性检测：选取40个血清样本，分别用已有酶联免疫方法的检测试剂盒作为参考方法与上述制备发光板的检测结果作为试验方法，二者进行相关分析，结果显示线性关系良好，检测结果如下：当前第1页12