本发明涉及一种邻位连接技术用于体外免疫诊断检测人体内RBP的含量，属于疾病诊断检测领域。
背景技术：
视黄醇结合蛋白(RetinoL Binding Protein，RBP)为血浆中由肝脏分泌的一种小分子蛋白质，由一条183个氨基酸残基组成的多肽链及少部分糖类组成，不含中性糖和氨基已糖，分子量为21,000Da。RBP主要由肝细胞的粗面内质网合成，广泛分布于人体血清、脑脊液、尿液及其他体液中，最终由尿排出。它也是血液中维生素A的转运蛋白，在维生素A的代谢中发挥重要作用。由于其半衰期较短，所以能较为敏感地反映机体的疾病状况。
近年来，RBP检测及临床应用日益受到关注，检测血清RBP和尿液RBP水平对肝脏、肾脏疾病的早期诊断和疗效观察有重要意义，也经常作为临床营养状况评价的指标，用来特异地诊断早期营养不良。
目前用于检测血、尿中RBP含量的方法较多，常用的有酶联免疫吸附试验法和免疫比浊法等。酶联免疫吸附试验法具有操作简单，试剂稳定期长的特点，但酶联免疫吸附试验法的检测灵敏度较低，而现在应用于临床常采用免疫比浊法，该技术已趋于成熟，操作简便，干扰因素少，但液态的胶乳试剂稳定性不佳，检测结果精准性不佳。而本发明提出的基于一种邻位连接技术检测RBP含量的免疫诊断检测方法，具有检测灵敏度高、检测特异性强、样品损耗低、操作简单、检测设备常见等优势，将其应用于肾损伤疾病的监测，可以提高肾损伤疾病诊断的准确率，具有极大的市场价值。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供一种可用于定量检测RBP的检测试剂盒、其制备及使用方法。
本发明通过以下技术方案实现：
一种制备基于邻位连接技术定量检测RBP含量的试剂盒的方法，包括如下步骤：
1)抗RBP抗体偶联寡聚核苷酸的RBP探针A；
2)抗RBP抗体偶联寡聚核苷酸的RBP探针B；
在上述技术方案中，所述抗RBP抗体为针对RBP不同表位的单克隆抗体或多克隆抗体。
根据以上任一技术方案所述所制备的基于邻位连接技术的RBP检测试剂盒。其主要组成包括：
1)RBP探针A；
2)RBP探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
以上任一技术方案所述的试剂盒的使用方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入RBP探针A和RBP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
附图说明
图1是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒原理示意图，其中，1-寡聚脱氧核苷酸，2-偶联剂，3-抗RBP抗体，4-待测物(RBP)，5-寡聚脱氧核苷酸，6-偶联剂，7-抗RBP抗体，8-Taqman荧光探针，9-Taq酶
图2是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒检测线性范围图。
图3是本发明实施例提供的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒结果相关性比较。
具体实施方式
以下参考附图对本发明的一种邻位连接技术用于定量检测RBP含量的试剂盒、制备及其使用方法进行详细说明。
实施例1
RBP探针A的制备：
1)取0.1mg抗RBP抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入5’端修饰有叠氮基团的寡聚脱氧核苷酸a，4℃过夜孵育，即得到RBP探针A。
实施例2
RBP探针B的制备：
1)取0.1mg抗RBP抗体与DBCO-sulfo-NHS试剂进行共孵育5-30min；
2)反应结束后，加入10μL 0.5mol/L Tris-HCl，孵育5-10min以终止反应；
3)将上述被修饰的抗体加入5’端修饰有叠氮基团的寡聚脱氧核苷酸b，4℃过夜孵育，即得到RBP探针B。
实施例3
试剂盒主要组成：
1)RBP探针A；
2)RBP探针B；
3)连接缓冲液；
4)qPCR反应液。
实施例4
试剂盒使用方法，包括如下步骤：
1)将待测样本加入到反应孔中，再加入RBP探针A和RBP探针B，孵育5-30min后加入到连接缓冲液反应5-30min，最后与qPCR反应液进行混合；
2)对上述1)中的最终反应液进行qPCR，测量计算每个反应孔的Ct值。
此试剂盒的反应孔可以是微孔板、微流控试剂盘、反应杯、反应管等。
实施例5
本发明试剂盒方法学评价：
1.线性
配制浓度为0μg/mL、5μg/mL、25μg/mL、100μg/mL、300μg/mL的RBP标准品溶液。在反应孔中分别加入10μL标准品、加入100μL RBP探针A，加入100μL RBP探针B，37℃温育10分钟。温育后，加入20μL连接缓冲液反应10min后，再加入20μL qPCR反应液进行qPCR反应，测量计算每个反应孔的Ct值。
以Ct值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准工作曲线(见附图2)。
2.准确度
相关性比对：如图3所示，与重庆中元RBP试剂盒的相关性为：y＝0.949x+2.469，R2＝0.997。
本发明与现有方法和产品相比，具有检测灵敏度高、特异性好、成本较低，对检测仪器要求低的优点。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。