本发明涉及一种测定动物组织自由水和结合水含量的方法，属于医学技术领域。
背景技术：
自由水和结合水的研究主要应用于建筑、水利、化工和农业领域。而对于动物组织的自由水和结合水研究却极其稀少，其含量测定的方法更是从未有报道。
动物组织中水的形态有自由水和结合水两种形式。自由水作为一种良好溶剂可以将生物体内或细胞内营养物质运到各个细胞，将代谢废物运到排泄器官。结合水分为弱结合水和强结合水，是以氢键和极性键结合在有机固体物质上。细胞内自由水和结合水的含量测定,对研究疾病的生理、病理、诊断及治疗具有重要意义。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题，在于提供一种拟获取生理状态下动物正常肌肉组织和病理状态下动物荷肝癌组织，采用加热称重法检测细胞内自由水和结合水含量，同时摸索加热条件及称重时间，以期建立动物组织自由水和结合水含量的测定方法。
本发明通过下述方案实现：一种测定动物组织自由水和结合水含量的方法，其包括以下步骤：
步骤一：动物、瘤株及仪器准备；
步骤二：动物分组，将动物随机分为生理组织组和病理组织组，每组10只；
步骤三：对病理组动物腋下注射h22细胞建立h22荷瘤模型，对生理组织组不做处理，正常喂养；
步骤四：实验过程，在步骤三的h22荷瘤模型造模14d后，处死各组动物，并分别取出生理组织组和病理组织组的右后肢肌肉组织；并将各组组织样本取0.3g，记录各组样本鲜重m，切割至大小相同，置于载玻片上，记录总重w，对于自由水的干燥温度设置为75℃，对于结合水的干燥温度分别设置在100℃和120℃；
步骤五：数据处理，在各时刻称重后，计算得失水量：失水量＝总重—该时刻称得总重；
步骤六：统计分析，数据以
所述步骤三中，对病理组动物腋下注射h22细胞建立h22荷瘤模型包括动物肝癌h22细胞的培养及传代和动物模型制作。
所述动物肝癌h22细胞的培养及传代包括以下过程，首先将腹水型动物肝癌h22细胞放置在温度为35-37℃、含3-5％co2的培养箱，用含8-10％fcs的rpmi1640完全培养基悬浮培养，取最佳生长状态的动物肝癌h22细胞，将浓度调为5×106个/ml，以0.2-0.4ml/只无菌注入动物腹腔进行接种传代，7-9天后，动物腹部膨隆，出现腹水，用于动物皮下移植瘤的接种。
所述动物模型制作包括以下过程，将接种h22瘤种7-9天，腹水隆起明显的腹水瘤动物以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，以无菌生理盐水稀释后，1500-2000r/min离心5-10min，调整瘤细胞浓度为5×106个/ml，在动物右腋下进行皮下无菌接种，接种量为每只0.2-0.4ml/只，建立荷h22肝癌动物模型。
所述步骤四中干燥过程采用电热鼓风干燥箱。
所述步骤一中动物采用spf级雄性km小鼠，体质量20±2g。
本发明的有益效果为：能够有效检测出动物组织自由水和结合水的含量，以及不同组织需烘烤不同的时间才能达到恒重，以加热称重得出生理组肌肉组织自由水须在75℃加热4h，病理组肿瘤组织自由水须在75℃加热5h；生理组肌肉组织和病理组肿瘤组织弱结合水须在100℃加热2h，强结合水须在120℃加热1h，对动物组织中自由水和结合水的研究有益于肿瘤病症的早期诊断和抗肿瘤药物研究，也可用于抗衰老药物的研究。
具体实施方式
下面对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限所述内容。
为了清楚，不描述实际实施例的全部特征，在下列描述中，不详细描述公知的功能和结构，因为它们会使本发明由于不必要的细节而混乱，应当认为在任何实际实施例的开发中，必须做出大量实施细节以实现开发者的特定目标，例如按照有关系统或有关商业的限制，由一个实施例改变为另一个实施例，另外，应当认为这种开发工作可能是复杂和耗费时间的，但是对于本领域技术人员来说仅仅是常规工作。
实施例1：本实验拟获取生理状态下小鼠正常肌肉组织和病理状态下小鼠荷肝癌组织，采用加热称重法检测细胞内自由水和结合水含量，同时摸索加热条件及称重时间，以期建立动物组织自由水和结合水含量的测定方法。
1实验
1.1动物及瘤株
动物：spf级雄性km小鼠，体质量20±2g，江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(赣)2011—0001。
瘤株：小鼠h22肝癌细胞来源：中国医学科学院肿瘤细胞库提供。
1.2仪器
倒置显微镜(德国徕卡,dmi3000b)；电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，xz-9030mbe)；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，sqp型)。
1.3动物处理
1.3.1动物分组
将km小鼠随机分为生理组织组和病理组织组，每组10只，对病理组小鼠腋下注射h22细胞建立h22荷瘤模型，对生理组不做处理，正常喂养。
1.3.2肝癌h22细胞接种方法
小鼠肝癌h22细胞的培养及传代：将腹水型小鼠肝癌h22细胞，于36℃、4％co2培养箱，用含9％fcs的rpmi1640完全培养基悬浮培养，取最佳生长状态的小鼠肝癌h22细胞，浓度调为5×106个/ml，以0.3ml/只无菌注入小鼠腹腔进行接种传代，于8天，小鼠腹部膨隆，出现腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接种。
1.3.3动物模型制作
荷h22肝癌小鼠模型的建立：将接种h22瘤种8天，腹水隆起明显的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，以无菌生理盐水稀释后，1800r/min离心7min，调整瘤细胞浓度为5×106个/ml，于小鼠右腋下进行皮下无菌接种，接种量为每只0.3ml/只。
1.4实验过程
在造模14d后，处死各组小鼠，并分别取出生理组织组和病理组织组的后肢肌肉组织(由于小鼠前肢肌肉太少，无法取得足够的量，故取右后肢肌肉)，并将各组组织样本取约0.3g，记录各组样本鲜重m，切割至大小相似，置于载玻片上，记录总重w，动物组织在75℃烘烤时失水即为自由水，而结合水则需要在105-107℃的高温下才容易被烘烤出来，在100℃烘烤时失水为弱结合水，而在120℃时失水为强结合水，因此对于结合水的温度分别设置在100℃和120℃。
1.5数据处理
各时刻称重后，计算得失水量：失水量＝总重—该时刻称得总重。
1.6统计分析
数据以
实施例2：本实验拟获取生理状态下小鼠正常肌肉组织和病理状态下小鼠荷肝癌组织，采用加热称重法检测细胞内自由水和结合水含量，同时摸索加热条件及称重时间，以期建立动物组织自由水和结合水含量的测定方法。
1实验
1.1动物及瘤株
动物：spf级雄性km小鼠，体质量20±2g，江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(赣)2011—0001。
瘤株：小鼠h22肝癌细胞来源：中国医学科学院肿瘤细胞库提供。
1.2仪器
倒置显微镜(德国徕卡,dmi3000b)；电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，xz-9030mbe)；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，sqp型)。
1.3动物处理
1.3.1动物分组
将km小鼠随机分为生理组织组和病理组织组，每组10只，对病理组小鼠腋下注射h22细胞建立h22荷瘤模型，对生理组不做处理，正常喂养。
1.3.2肝癌h22细胞接种方法
小鼠肝癌h22细胞的培养及传代：将腹水型小鼠肝癌h22细胞，于35℃、3％co2培养箱，用含8％fcs的rpmi1640完全培养基悬浮培养，取最佳生长状态的小鼠肝癌h22细胞，浓度调为5×106个/ml，以0.4ml/只无菌注入小鼠腹腔进行接种传代，于9天，小鼠腹部膨隆，出现腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接种。
1.3.3动物模型制作
荷h22肝癌小鼠模型的建立：将接种h22瘤种9天，腹水隆起明显的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，以无菌生理盐水稀释后，2000r/min离心10min，调整瘤细胞浓度为5×106个/ml，于小鼠右腋下进行皮下无菌接种，接种量为每只0.4ml/只。
1.4实验过程
在造模14d后，处死各组小鼠，并分别取出生理组织组和病理组织组的后肢肌肉组织(由于小鼠前肢肌肉太少，无法取得足够的量，故取右后肢肌肉)，并将各组组织样本取约0.3g，记录各组样本鲜重m，切割至大小相似，置于载玻片上，记录总重w，动物组织在75℃烘烤时失水即为自由水，而结合水则需要在105-107℃的高温下才容易被烘烤出来，在100℃烘烤时失水为弱结合水，而在120℃时失水为强结合水，因此对于结合水的温度分别设置在100℃和120℃。
1.5数据处理
各时刻称重后，计算得失水量：失水量＝总重—该时刻称得总重。
1.6统计分析
数据以
实施例3：本实验拟获取生理状态下小鼠正常肌肉组织和病理状态下小鼠荷肝癌组织，采用加热称重法检测细胞内自由水和结合水含量，同时摸索加热条件及称重时间，以期建立动物组织自由水和结合水含量的测定方法。
1实验
1.1动物及瘤株
动物：spf级雄性km小鼠，体质量20±2g，江西中医药大学实验动物中心提供，许可证号：scxk(赣)2011—0001。
瘤株：小鼠h22肝癌细胞来源：中国医学科学院肿瘤细胞库提供。
1.2仪器
倒置显微镜(德国徕卡,dmi3000b)；电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司医疗设备厂，xz-9030mbe)；万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司，sqp型)。
1.3动物处理
1.3.1动物分组
将km小鼠随机分为生理组织组和病理组织组，每组10只，对病理组小鼠腋下注射h22细胞建立h22荷瘤模型，对生理组不做处理，正常喂养。
1.3.2肝癌h22细胞接种方法
小鼠肝癌h22细胞的培养及传代：将腹水型小鼠肝癌h22细胞，于37℃、5％co2培养箱，用含10％fcs的rpmi1640完全培养基悬浮培养，取最佳生长状态的小鼠肝癌h22细胞，浓度调为5×106个/ml，以0.2ml/只(1×106个细胞/只)无菌注入小鼠腹腔进行接种传代，于7天，小鼠腹部膨隆，出现腹水，可用于小鼠皮下移植瘤的接种。
1.3.3动物模型制作
荷h22肝癌小鼠模型的建立：将接种h22瘤种7天，腹水隆起明显的腹水瘤小鼠以脱颈法处死，无菌条件下从腹腔抽出瘤液，以无菌生理盐水稀释后，1500r/min离心5-10min，调整瘤细胞浓度为5×106个/ml，于小鼠右腋下进行皮下无菌接种，接种量为每只0.2ml/只。
1.4实验过程
在造模14d后，处死各组小鼠，并分别取出生理组织组和病理组织组的后肢肌肉组织(由于小鼠前肢肌肉太少，无法取得足够的量，故取右后肢肌肉)，并将各组组织样本取约0.3g，记录各组样本鲜重m，切割至大小相似，置于载玻片上，记录总重w，动物组织在75℃烘烤时失水即为自由水，而结合水则需要在105-107℃的高温下才容易被烘烤出来，在100℃烘烤时失水为弱结合水，而在120℃时失水为强结合水，因此对于结合水的温度分别设置在100℃和120℃。
1.5数据处理
各时刻称重后，计算得失水量：失水量＝总重—该时刻称得总重。
1.6统计分析
数据以
2结果
2.175℃不同烘烤时间各组样本自由水失水量结果
2.1.175℃不同烘烤时间肌肉组织自由水失水量结果：2h失水量有明显提高,与1h比较，差异具有统计学意义(p<0.05)；3h失水量也有显著提高，与2h比较，差异具有统计学意义；4h失水量有显著提高，与3h比较，差异具有统计学意义(p<0.05)。因此生理组肌肉组织自由水烘烤至4h达到恒重。见表1。
表175℃不同烘烤时间对肌肉组织自由水失水量结果
注：与1h比较，*p<0.05；与2h相比，#p<0.05；与3h相比，▲p<0.05
2.1.275℃不同烘烤时间肿瘤组织自由水失水量结果：2h失水量有明显提高,与1h比较，差异具有统计学意义(p<0.05)；3h失水量也有显著提高，与2h比较，差异具有统计学意义(p<0.05)；4h失水量有显著提高，与3h比较，差异具有统计学意义(p<0.05)；5h失水量有显著提高，与4h比较，差异具有统计学意义(p<0.05)。因此对于病理组肿瘤组织烘烤至5h达到恒重。见表2。
表275℃不同烘烤时间对肿瘤组织组织自由水失水量结果
注：与1h相比，*p<0.05；与2h相比，#p<0.05；与3h相比，▲p<0.05；与4h相比，◆p<0.05。
2.2100℃烘烤各组样本弱结合水失水量结果
2.2.1100℃烘烤肌肉组织弱结合水失水量结果：2h失水量有显著提高，与1h比较，差异具有显著性差异(p<0.05)。因此肌肉组织弱结合水烘烤至2h达到恒重。见表3。
表3100℃烘烤肌肉组织弱结合水失水量结果
注：与1h相比，*p<0.05
2.2.2100℃烘烤肿瘤组织弱结合水失水量结果：2h失水量有显著提高，与1h比较，差异具有显著性差异(p<0.05)。因此肿瘤组织弱结合水烘烤至2h达到恒重。见表4。
表4100℃烘烤肿瘤组织弱结合水失水量结果
注：与1h相比，*p<0.05
2.3120℃烘烤各组样本强结合水失水量结果
2.3.1120℃烘烤肌肉组织强结合水失水量结果：对于生理组肌肉组织强结合水烘烤至1小时达到恒重。见表5。
表5120℃烘烤肌肉组织强结合水失水量结果
2.3.2120℃烘烤肌肉组织强结合水失水量结果：对于病理组肿瘤强结合水烘烤至1小时达到恒重。见表6。
表6120℃烘烤肿瘤组织强结合水失水量结果
3、讨论
研究表明，对动物组织中自由水和结合水的研究有益于肿瘤病症的早期诊断和抗肿瘤药物研究，也可用于抗衰老药物的研究。
本实验研究结果表明，以加热称重得出生理组肌肉组织自由水须在75℃加热4h，病理组肿瘤组织自由水须在75℃加热5h；生理组肌肉组织和病理组肿瘤组织弱结合水须在100℃加热2h，强结合水须在120℃加热1h。本次实验通过加热称重法成功建立了动物组织自由水结合水含量测定方法并且不同组织需烘烤不同的时间才能达到恒重。
尽管已经对本发明的技术方案做了较为详细的阐述和列举，应当理解，对于本领域技术人员来说，对上述实施例做出修改或者采用等同的替代方案，这对本领域的技术人员而言是显而易见，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。