本发明涉及一种外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测用试剂盒。
背景技术：
外泌体是由多种细胞释放的纳米级（直径为50-100nm）的膜结合囊泡，可由肿瘤细胞大量释放。外泌体可存在于多种体液中，比如：各种体液如羊水，腹水，唾液，血清，血浆，乳汁，尿液，脑脊髓液等。外泌体携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类、DNA、mRNA、miRNA等。外泌体通过转运mRNA、miRNA等促进肿瘤的发生，参与肿瘤恶性化进程。不仅如此，外泌体还参与血管生成，帮助肿瘤细胞逃避免疫反应，促进肿瘤的侵袭和转移以及上皮间质化，重塑肿瘤微环境。最近的证据已经强调了缺氧肿瘤细胞释放的外泌体在促进肿瘤进展中的作用。例如在乳腺癌细胞中，缺氧被认为是触发释放外泌体的因素,在缺氧情况下，外泌体可以激活HIF-1α增强细胞的侵袭能力；外泌体可以促使肿瘤微环境酸化，PH值降低；促进肿瘤细胞抵抗辐射能力。鉴于将缺氧微环境和外泌体介导的信号独立连接到侵袭性肿瘤表型的观察结果，研究缺氧是否可能通过改变的外泌体释放来促进肿瘤进展是非常有意义的。
外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测对科学研究是十分重要的，因此建立合适的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法是进行相关科学研究的重要步骤。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种简便、易操作的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法及试剂盒。
本发明的技术解决方案是：
一种非诊断用途的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法，其特征是：包括下列步骤：
（一）缺氧微环境模型构建：采用下列方法之一：
（1）物理缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；1 % O2、5 % CO2、94 % N2，37 ℃条件下培养 24 h，缺氧处理前为细胞更换新鲜培养基；缺氧处理是在密闭容器中以10 L/min 流量充入配制好的混合气体，所述混合气体：vol/vol：95 % N2、5 % CO2，持续10 min 后关闭进、出气口，测氧仪测得容器内O2最终体积分数为1 %；
（2）化学缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；在培养基中加入浓度为50、100、150、200 μmol/L的CoCl2用于模拟肿瘤内部乏氧微环境，选取最适浓度用于后续实验；
（二）外泌体的提取和纯化
（1）常氧、缺氧条件下培养的细胞条件培养基在4℃、300g的离心条件下离心10分钟，500g的离心条件下离心10分钟，分离以去除血液中的细胞，然后得到上层培养基；
（2）将步骤（1）所得上清在4℃、10000g的离心条件下离心60分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液；
（3）将上清液移入新的离心管中，并向其中加入PBS吹打混匀重悬后，在4℃、10000g离心1小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的外泌体；
（三）电镜鉴定外泌体
（1）将上述所得到的外泌体用PBS溶液重悬；
（2）滴加 20mL/L pH6.8的磷钨酸溶液1:1混匀；
（3）取上述混匀液体 5ul滴于载样铜网上，室温下负染10分钟，白织灯下烤干；
（4）透射电镜下拍照鉴定外泌体形态、大小；典型结构：双层脂质膜结构，粒径40 ~ 100nm；
（四）外泌体总蛋白样品制备
（1）以100 μl裂解液重悬沉淀并反复吹打3-5 min，混匀后于4 ℃冰浴30 min；所述裂解液组成： NEA 97μl、CM 1μl、PI 1μl、DTT 1μl；
（2）沸水煮15 min，4℃以12000 g/min离心10 min；
（3）取上清作为外泌体总蛋白质，采用BCA法测定样品蛋白质的浓度，分装后储于-80℃保存、备用；
（五）凝胶电泳和蛋白质免疫检测
（1）将胶板用蒸馏水冲洗干净，晾干，进行配胶，根据MMP-13蛋白分子量配置12%的胶；
（2）在电泳槽中加入电泳缓冲液后上样，蛋白含量为20 ug，电泳；安装电极，接上电源，恒压80 V，使蛋白质跑到同一条起跑线上，蛋白质跑至分离胶上时改为120 V；
（3）切胶，放入转膜缓冲液；将PVDF膜放置在甲醇中极化，蒸馏水中水化后放入转膜液，与棉垫及滤纸一起在转膜缓冲液中平衡15 min；
（4）将PVDF膜、胶、棉垫及滤纸制作成“三明治”结构，第一层为棉垫，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为PVDF膜，第五层为滤纸，第六层为棉垫，夹紧；放入转膜槽内，加入转膜液和冰盒，转膜槽放在装满冰水的盆里；安装电极、接好电源，转膜条件设定为恒流300 mA，90 min；
（5）转膜结束后，取出PVDF膜，进行标记，放在摇床上，TBST洗5 min × 3次，5 %脱脂牛奶封闭1~2 h；TBST洗膜5 min × 3次；抗MMP-13抗体孵育，室温1 h后4 ℃过夜；
（6）TBST洗膜10 min × 3次；抗兔二抗孵育，室温2 h；TBST洗20 min × 3次；
（7）暗室内显影，冲洗X感光胶片；胶片予扫描仪扫描后分析其灰度；对比目的蛋白与内参蛋白Flotilin的灰度值，所得的比值为目的蛋白的相对表达量。
一种外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测用试剂盒，其特征是：包括下列材料：
（1）浓度为50、100、150、200 μmol/L的CoCl2；
（2）PBS溶液；
（3）20mL/L pH6.8的磷钨酸溶液；
（4）100 μl裂解液；所述裂解液组成： NEA 97μl、CM 1μl、PI 1μl、DTT 1μl；
（5）转膜缓冲液；
（6）PVDF膜、胶、棉垫及滤纸；
（7）TBST洗液，5 %脱脂牛奶，抗MMP-13抗体；
（8）抗兔二抗。
本发明方法简便、易操作，效果好。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
具体实施方式
一种非诊断用途的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法，包括下列步骤：
（一）缺氧微环境模型构建：采用下列方法之一：
（1）物理缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；1 % O2、5 % CO2、94 % N2，37 ℃条件下培养 24 h，缺氧处理前为细胞更换新鲜培养基；缺氧处理是在密闭容器中以10 L/min 流量充入配制好的混合气体，所述混合气体：vol/vol：95 % N2、5 % CO2，持续10 min 后关闭进、出气口，测氧仪测得容器内O2最终体积分数为1 %；
（2）化学缺氧模型：取生长状态良好的细胞用于实验；在培养基中加入浓度为50、100、150、200 μmol/L的CoCl2用于模拟肿瘤内部乏氧微环境，选取最适浓度用于后续实验；
（二）外泌体的提取和纯化
（1）常氧、缺氧条件下培养的细胞条件培养基在4℃、300g的离心条件下离心10分钟，500g的离心条件下离心10分钟，分离以去除血液中的细胞，然后得到上层培养基；
（2）将步骤（1）所得上清在4℃、10000g的离心条件下离心60分钟，分离以去除细胞器及其他杂质，得到上清液；
（3）将上清液移入新的离心管中，并向其中加入PBS吹打混匀重悬后，在4℃、10000g离心1小时，移除上层清液后，得到沉淀于该离心管底部的外泌体；
（三）电镜鉴定外泌体
（1）将上述所得到的外泌体用PBS溶液重悬；
（2）滴加 20mL/L pH6.8的磷钨酸溶液1:1混匀；
（3）取上述混匀液体 5ul滴于载样铜网上，室温下负染10分钟，白织灯下烤干；
（4）透射电镜下拍照鉴定外泌体形态、大小；典型结构：双层脂质膜结构，粒径40 ~ 100nm；
（四）外泌体总蛋白样品制备
（1）以100 μl裂解液重悬沉淀并反复吹打3-5 min，混匀后于4 ℃冰浴30 min；所述裂解液组成： NEA 97μl、CM 1μl、PI 1μl、DTT 1μl；
（2）沸水煮15 min，4℃以12000 g/min离心10 min；
（3）取上清作为外泌体总蛋白质，采用BCA法测定样品蛋白质的浓度，分装后储于-80℃保存、备用；
（五）凝胶电泳和蛋白质免疫检测
（1）将胶板用蒸馏水冲洗干净，晾干，进行配胶，根据MMP-13蛋白分子量配置12%的胶；
（2）在电泳槽中加入电泳缓冲液后上样，蛋白含量为20 ug，电泳；安装电极，接上电源，恒压80 V，使蛋白质跑到同一条起跑线上，蛋白质跑至分离胶上时改为120 V；
（3）切胶，放入转膜缓冲液；将PVDF膜放置在甲醇中极化，蒸馏水中水化后放入转膜液，与棉垫及滤纸一起在转膜缓冲液中平衡15 min；
（4）将PVDF膜、胶、棉垫及滤纸制作成“三明治”结构，第一层为棉垫，第二层为滤纸，第三层为胶，第四层为PVDF膜，第五层为滤纸，第六层为棉垫，夹紧；放入转膜槽内，加入转膜液和冰盒，转膜槽放在装满冰水的盆里；安装电极、接好电源，转膜条件设定为恒流300 mA，90 min；
（5）转膜结束后，取出PVDF膜，进行标记，放在摇床上，TBST洗5 min × 3次，5 %脱脂牛奶封闭1~2 h；TBST洗膜5 min × 3次；抗MMP-13抗体孵育，室温1 h后4 ℃过夜；
（6）TBST洗膜10 min × 3次；抗兔二抗孵育，室温2 h；TBST洗20 min × 3次；
（7）暗室内显影，冲洗X感光胶片；胶片予扫描仪扫描后分析其灰度；对比目的蛋白与内参蛋白Flotilin的灰度值，所得的比值为目的蛋白的相对表达量。
一种外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测用试剂盒，包括下列材料：
（1）浓度为50、100、150、200 μmol/L的CoCl2；
（2）PBS溶液；
（3）20mL/L pH6.8的磷钨酸溶液；
（4）100 μl裂解液；所述裂解液组成： NEA 97μl、CM 1μl、PI 1μl、DTT 1μl；
（5）转膜缓冲液；
（6）PVDF膜、胶、棉垫及滤纸；
（7）TBST洗液，5 %脱脂牛奶，抗MMP-13抗体；
（8）抗兔二抗。
上述外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测用试剂盒，其使用方法，也就是上述非诊断用途的外泌体生物标志物MMP-13的提取、检测方法。