本发明涉及纳米复合材料，化学修饰电极与电分析化学技术领域，尤其涉及一种基于羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维和肌红蛋白修饰电极的制备方法及其电化学分析应用。
背景技术
静电纺丝技术的原理是使高分子溶液带电，通过电路将喷丝口和接受装置串联在高压电场中；当由电路产生的静电吸引力大于高分子溶液之间的表面张力时，高分子溶液会从纺丝喷头中喷出，喷出的带电液滴在电场中运动；与此同时，带电液滴在电场中被拉伸和卷曲，由于纺丝溶剂在不断被蒸发干，纺丝的直接可缩小到几百或几十纳米，并最终在接收器上得到纺丝材料；静电纺丝技术可以制备包括有机、有机/无机复合和无机纳米纤维等不同种类的纳米纤维；静电纺丝装置主要分为3个部分：高压直流电源是提供电压，在喷丝装置与目标电极之间形成强电场，以便对带电聚合物进行高倍拉伸；喷丝装置一般有储液装置和喷丝部分组成；目标电极的作用是提供负极以便收集纤维。
生物体的骨骼一种是由i型胶原纤维和羟基磷灰石组成的纤维增强复合材料，其中羟基磷灰石矿物质是人体骨骼和脊椎动物硬组织中的组成部分，具有卓越的生物相容性、骨传导率和生物活性；由于这些优良的性能，在医学方面用于脊柱融合术和骨缺损治疗；但是羟基磷灰石的机械性能比较差，限制了其在医学领域的广泛应用；通过静电纺丝技术制备的纳米纤维，具有优异的生物相容性、机械强度大、密度低等优点；进一步通过高温碳化纳米纤维可得到羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维；碳纳米纤维适合作为羟基磷灰石的附着载体，同时，由于羟基磷灰石的存在，碳纳米纤维-羟基磷灰石表现出了优异的协同效应。
化学修饰电极是将修饰物固定在工作电极表面制备的一种新型工作电极，由于修饰物的存在而使电极表现出特定的化学和电化学性能，已成为电化学和电化学分析领域的研究热点；电化学酶传感器是将生物酶固定在电极表面与电极表面进行直接电子传递，实现了化学信号到电信号的转变。
肌红蛋白(myoglobin,mb)是一种氧结合血红素蛋白，它是由一条肽链和一个血红素辅基组合的蛋白；其中血红素是铁卟淋化合物，它由4个吡咯通过4个甲炔基相连成一个大环，fe2+居于环中；血红素的fe2+与4个吡咯环的氮原子形成配位键，另2个配位键1个与f8组氨酸结合，1个与o2结合，故血红素为肌红蛋白的电化学活性中心。
三氯乙酸(tca)是有机卤素环境污染物之一，广泛应用于农业和公共安全领域，也经常存在于用次氯酸消毒过的饮用水中；亚硝酸盐是肉制品及其它食品加工过程中常用的一种食品添加剂；如果食品中亚硝酸盐含量超过国家标准30mg/kg时，就会产生有毒有害物质，引起食品中毒。
综上，研发一种新型纳米材料和血红素蛋白质修饰电极，达到对三氯乙酸和亚硝酸盐这两种物质能快速且准确检测显得尤为重要。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提供了一种基于羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维和肌红蛋白修饰电极的制备方法及其电化学分析应用，制得的修饰电极对三氯乙酸和亚硝酸钠电催化还原效果良好，表现出线性范围宽，检测限低，灵敏度高等优点，可很好应用于检测这两种物质在目标物中含量。
本发明采用的技术手段如下：一种基于羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维和肌红蛋白修饰电极的制备方法，包括以下步骤：
s1、按照质量比（1.5~2.5）:1取石墨粉与离子液体hppf6在研钵中研磨均匀得到碳糊，然后将碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极(cile)；
s2、取6~10μlha-cnf与mb混合溶液滴涂在cile表面，混合溶液中mb溶液浓度为15mg/ml,ha-cnf溶液浓度为1.5mg/ml；室温条件下避光自然晾干，得到mb/ha-cnf/cile电极；
s3、最后取4~8μl0.3~0.7%nafion乙醇溶液滴涂在mb/ha-cnf/cile电极表面，室温下避光晾干后即得到nafion/mb/ha-cnf/cile电极。
进一步的，所述s1步骤中，石墨粉与离子液体hppf6的质量比为2:1；所述研磨时间为1h以上；所述玻璃电极管内径为4mm。
进一步的，所述s3步骤中，nafion乙醇溶液的体积浓度为0.5%。
本发明任一项所述的一种基于羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维和肌红蛋白修饰电极用于电催化还原三氯乙酸和亚硝酸钠。
本发明所述的羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维和肌红蛋白修饰电极的检测环境为在ph3.0的磷酸盐缓冲溶液中。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用的ha-cnf材料是将静电纺丝技术制备的羟基磷灰石掺杂聚丙烯腈(ha-pan)进行高温碳化制备的一种碳纳米纤维复合材料。ha具有良好的生物活性和生物相容性，是生物体的牙齿和骨胳的主要无机矿物组成；cnf具有长的纤维结构和优异的导电性能，两者复合后的ha-cnf复合材料具有良好的导电性和生物相容性，有利于负载mb并促进mb在修饰电极表面的直接电子转移，为其电子转移提供快速通道，加快电子转移速率；本发明采用混合滴涂制备的nafion/mb/ha-cnf/cile在ph3.0pbs中循环伏安扫描出现了一对峰形良好的氧化还原峰且电极对tca和nano2电催化还原效果良好，线性范围分别为6.0~180mmol/l和0.7~10mmol/l,检测限为2.0mmol/l和0.23mmol/l，表现出线性范围宽，检测限低，灵敏度高等优点，可很好应用于检测tca和nano2在目标物中含量。
附图说明
图1为不同修饰电极在ph3.0的pbs缓冲溶液中扫描速度为100mv/s时循环伏安图，其中
曲线a为对比例2的nafion/ha-cnf/cile电极的循环伏安曲线；
曲线b为对比例3的nafion/cile电极的循环伏安曲线；
曲线c为对比例1的nafion/mb/cile电极的循环伏安曲线；
曲线d为实施例1的nafion/mb/ha-cnf/cile电极的循环伏安曲线。
图2为nafion/mb/ha-cnf/cile修饰电极在不同扫描速度下的循环伏安图(从a到k分别为50,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000mvs-1)。
图3为不同ph缓冲溶液中nafion/mb/ha-cnf/cile的循环伏安图(从a到f分别为：3.0,4.0,5.0,6.0,7.0,8.0)。
图4为修饰电极在不同浓度tca存在下的循环伏安图(从a到m为6.0,70,80,900,100,110,120,130,140,150,160,170,180mmol/l)，插图为还原峰电流与tca的浓度之间的关系曲线图。
图5修饰电极在不同浓度nano2存在下的循环伏安图，(从a到j为0.7,0.8,1.0,1.2,1.6,2.0,3.0,4.0,5.5,10mmol/l)，插图为还原峰电流与nano2的浓度之间的关系曲线图。
图6为修饰电极上的修饰材料ha-cnf的扫描电镜表征图。
具体实施方式
以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例1
一种基于羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维和肌红蛋白修饰电极的制备方法，包括以下步骤：
s1、按照质量比2:1取石墨粉与离子液体hppf6，即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6在研钵中研磨1.5h-2h得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极cile；
每次进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
s2、取8μlha-cnf与mb混合溶液滴涂在cile表面，混合溶液中mb溶液浓度为15mg/ml,ha-cnf溶液浓度为1.5mg/ml。室温条件下避光自然晾干，得到mb/ha-cnf/cile电极；
s3、最后取6μl体积浓度为0.5%nafion乙醇溶液滴涂在mb/ha-cnf/cile电极表面，室温下避光晾干后，即得到nafion/mb/ha-cnf/cile电极，制备完后置于暗处保存。
对比例1
一种肌红蛋白修饰电极的制备方法，包括以下步骤：
s1、按照质量比2:1取石墨粉与离子液体hppf6，即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6在研钵中研磨1.5h-2h，得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极cile；
每次进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
s2、取8μl15mg/mlmb溶液滴涂在cile表面，在室温下避光自然晾干，得到mb/cile电极；
s3、取6μl体积浓度为0.5%nafion乙醇溶液滴涂在mb/cile电极表面，室温下避光晾干后，即得到nafion/mb/cile电极，制备完后置于暗处保存。
对比例2
一种羟基磷灰石掺杂碳纳米纤维修饰电极的制备方法，包括以下步骤：
s1、按照质量比2:1取石墨粉与离子液体hppf6，即取1.6g石墨粉、0.8g离子液体hppf6在研钵中研磨1.5h-2h得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极cile；
每次进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
s2、取8μl1.5mg/mlha-cnf溶液滴涂在cile表面，室温条件下避光自然晾干，得到ha-cnf/cile电极；
s3、取6μl体积浓度为0.5%nafion乙醇溶液滴涂在ha-cnf/cile电极表面，室温下避光晾干后，即得到nafion/ha-cnf/cile电极，制备完后置于暗处保存。
对比例3
一种cile极的制备方法，包括以下步骤：
s1、按照质量比2:1取石墨粉与离子液体hppf6，即取1.6g石墨粉和0.8g离子液体hppf6在研钵中研磨1.5h-2h得到碳糊，然后将碳糊填入4mm玻璃电极管中压实，内插铜丝作为导线，得到碳离子液体电极cile；
进行电极修饰前需将电极表面在打磨纸上打磨至镜面；
s2、取6μl体积浓度为0.5%nafion乙醇溶液滴涂在cile表面，室温下避光晾干后，即得到nafion/cile电极，制备完后置于暗处保存。
一、研究电化学交流阻抗图谱
电化学交流阻抗谱(eis)能够反应出电极在其表面修饰过程后的界面电阻变化行为信息，且电子转移电阻(ret)能通过在电化学工作站软件中高频区域的半圆弧的直径求得。本发明考察了不同修饰电极在10mmol/l[fe(cn)6]3-/4-和0.1mol/lkcl混合溶液中扫描频率范围于105至0.1hz的电化学交流阻抗图谱；nafion/ha-cnf/cile阻抗值最小为19.8ω，表明ha-cnf纳米材料具有良好导电性；nafion/mb/cile的阻抗值最大为110ω，表明mb的存在阻碍了电子的传递，增大了界面电子传递电阻；实施例1的nafion/mb/ha-cnf/cile的阻抗值为46.72ω，比nafion/mb/cile明显减小，表明具有高导电性的ha-cnf的存在能够有效减小电子传递电阻。
二、研究了mb在ph=3的pbs缓冲溶液中的直接电化学行为
研究了mb在ph=3的pbs缓冲溶液中扫描速度100mv/s时的直接电化学行为，结果如图1所示，从图中可以看出，
在曲线(b)nafion/cile（对比例3）上，没有任何氧化还原峰出现，即表面没有电活性物质存在于电极表面；
在曲线(a)nafion/ha-cnf/cile（对比例2）上，几乎为一条平滑曲线，没有任何峰出现；
在曲线(c)nafion/mb/cile（对比例1）上，出现一对氧化还原峰，峰电流较小，这说明mb分子和cile电极之间存在着电子转移；
在曲线(d)nafion/mb/ha-cnf/cile（实施例1）上，出现一对峰形良好且稳定的氧化还原峰；随着ha-cnf的加入峰电流显著增大，这说明ha-cnf的存在加快了mb和cile电极之间电子转移速率；本发明中所用的ha-cnf为纤维状纳米材料、生物相容性好、导电性好、表面大等特点，在电极表面还能形成三维网络结构，有利于提高界面负载量，吸附固定大量的mb分子；
从曲线d中可以直接读出峰电位分别为epa=-0.164v和epc=-0.238v(vs.sce)，峰电位差(△ep)为0.074v，式电位e0'=-0.201v(vs.sce)，氧化还原峰电流之比接近于1，表现出蛋白质内血红素辅基fe(iii)/fe(ii)电对的特征电化学行为。
三、研究扫描速度对mb电化学信号响应的影响
研究了扫描速度对本发明实施例1的nafion/mb/ha-cnf/cile电极电化学信号响应的影响，结果如图2所示；在50~1000mv/s的扫描速度范围内，均得到了mb的一对对称的氧化还原峰，表明mb的直接电化学是一个准可逆的电极过程，且氧化还原峰电流(ipa与ipc)随扫描速度的升高而增大,线性回归方程分别为ipa(µa)=-130.6υ(v/s)–31.2(n=10，γ=0.995)和ipc(µa)=161.0υ(v/s)+9.99(n=10，γ=0.999)，表明mb在nafion/mb/ha-cnf/cile上的反应属于薄层电化学行为，此扫速范围内的电极反应由吸附过程控制；由公式q=nafγ*（q为电荷量，n为电极反应中的电子转移个数，a为电极的表观面积即内径为4mm的玻璃电极管内表面积，f是法拉第常数，γ*称为电活性物质在电极的表面覆盖度γ*），可以得出γ*值为1.43×10-9mol/cm2，高于单层覆盖量(1.89×10-11mol/cm2)；
随着扫描速度的增大，峰电位差△ep逐渐增大，e与lnυ的线性回归方程分别为：epc(v)=-0.0592lnυ(v/s)-0.286(n=10,γ=0.998)和epa(v)=0.0415lnυ(v/s)-0.102(n=10,γ=0.997)；根据laviron理论的公式（a,b,c），计算出电子转移数n=0.947，电子传递系数α=0.45。反应速率常数ks根据公式(c)可求出为1.10s-1，说明ha-cnf修饰电极中mb的直接电子转移具有较快速率：
四、研究ph对mb电化学信号响应的影响
研究磷酸盐缓冲溶液的ph对实施例1的nafion/mb/ha-cnf/cile电极直接电化学行为的影响，结果如图3所示，随着缓冲溶液的ph增大，即溶液的ph向往中性碱性方向移动时mb氧化还原峰电位均发生负方向移动；当ph在3.0~8.0范围内mb的电化学行为是一个准可逆过程，式电位（e0′）与ph值的大小会呈良好的线性关系，得到的线性回归方程：e0′(v)=-0.0541ph+0.016(n=6,γ=0.996)；由方程斜率可知式电位随着一个单位的ph的增加而增加-54.1mv，稍小于298k温度条件下可逆体系中的理论值（-59mv/ph），结果可得mb在电极上同时发生一个电子和一个质子的转移：mbfe(iii)+h++e
五、研究羟基磷灰石掺杂碳纤维和肌红蛋白修饰电极对tca电催化行为
本发明实施例1的nafion/mb/ha-cnf/cile电极在ph3.0的pbs缓冲溶液中电催化还原tca的催化效果，如图4所示；逐渐滴加0.1mol/ltca至10mlpbs溶液后，可观察到在-0.242v左右出现一个还原峰，随着tca浓度增加还原峰电流也随之增大，且在-0.528处出现第二个还原峰，并且其相应的氧化峰随着tca浓度增加逐渐减小甚至消失，这是一个典型的电催化tca还原过程。
当tca的浓度在6.0~180.0mmol/l的范围内时，还原峰电流和tca的浓度大小成良好的线性关系，得出线性回归方程为i(μa)=6.821c(mmol/l)+33.0(n=22,γ=0.998)，检测限为2.0mmol/l(3σ)，峰电流会在tca的浓度大于180mmol/l时出现一个平台电流值保持不变，这是michaelis-menten动力学过程的典型特征；表观米氏常数(kmapp)是在酶催化反应中考察酶-底物反应动力学的重要指标，根据lineweaver-burk方程：
上面公式中各参数的意义分别为iss是加底物后形成良好线性关系时的稳态电流，c是加入底物的浓度，imax是在tca的浓度大于180.0mmol/l时形成的饱和底物状态下所测得的最大电流；可根据双倒数作图法(1/iss~1/[tca])计算nafion/mb/ha-cnf/cile对tca的催化反应的kmapp为0.22mol/l，表明nafion/mb/ha-cnf/cile对三氯乙酸的电催化效果良好；这是由于ha-cnf复合材料具有良好的生物相容性和导电性有利于保持mb的生物结构，加快mb与修饰电极之间的电子转移速率，从而加强了对tca的催化效果。
六、研究羟基磷灰石掺杂碳纤维和肌红蛋白修饰电极对nano2电催化行为
本发明实施例1的nafion/mb/ha-cnf/cile电极电催化还原nano2的催化效果，如图5所示；在ph3.0的pbs缓冲溶液加入nano2后记录循环伏安曲线，发现在-0.790v出现新的还原峰，还原峰电流随着nano2浓度的增大而增大，当nano2的浓度在0.7~10.0mmol/l的范围内时还原峰电流和nano2的浓度大小成良好的线性关系，线性回归方程为i(μa)=3.927c(mmol/l)+99.0(n=10,γ=0.995)，检测限为0.23mmol/l(3σ)；峰电流会在nano2的浓度大于10mmol/l时出现一个平台且电流值保持不变.可根据双倒数作图法(1/iss~1/[nano2])计算nafion/mb/ha-cnf/cile对nano2的催化反应的kmapp为1.125mmol/l。
七、研究羟基磷灰石掺杂碳纤维纳米复合材料（ha-cnf）的扫描电子显微镜表征图。
利用扫描电子显微镜对所用材料的形貌进行了表征，结果如图6所示，从图中可清晰观察到ha-cnf具有长的纤维结构并且形成三维网状结构，有较多的空洞和通道，并且cnf表面凹凸不平，可以推断出ha成功掺杂进入cnf中。
综上所述，本发明采用的ha-cnf复合材料具有纳米纤维结构、优良的导电性和生物相容性其具有较大的比表面积和其良好的导电性促进mb在修饰电极表面的直接电子转移，加快电子转移速率；本发明采用混合滴涂制备的nafion/mb/ha-cnf/cile在ph3.0pbs中出现了一对峰形良好的氧化还原峰，对tca和nano2电催化还原效果良好，线性范围分别为6.0~180.0mmol/l和0.7~10.0mmol/l,检测限为2.0mmol/l和0.23mmol/l，可应用于检测tca和nano2在目标物中含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。