一种生物传感器的制作方法

本发明涉及传感器领域，具体涉及一种生物传感器。

背景技术

砷(ⅲ)对于动植物有强烈的毒害作用，由于砷(ⅲ)在土壤、水和农作物中的污染量不断增加，已成为一种常见的环境毒物，引起全球的广泛关注。当前的检测手段主要以砷斑法、银盐法、原子吸收光谱法和原子荧光光谱法为主。前两种手段为化学法，操作较为繁琐、灵敏度不高，不适应现代发展的需要；后两种检测手段为仪器分析法，虽有较高的准确性，但其所需仪器昂贵，且需要专业人员的操作，费力费时，难以满足大规模应用及实时原位检测的需要。所以研究出一种快速、简便、低成本、高灵敏度的砷(ⅲ)检测手段具有十分重要的意义。

压电传感器是近年来发展较快的一种生物传感器，它具有质量响应的高灵敏度和高特异性，检测简便快速，方法易于标准化。石英晶体微天平(qcm)是一类压电式传感器，已广泛应用于生物、医学、化学等领域,具有灵敏度高，体积小、设备简单、操作简便、检测费用低、能实时在线检测等优点。自组装单层膜技术是一种简单的表面修饰的方法，是分子通过化学键相互作用在自发吸附在固/液或气/固界面形成的有序排列的单分子层膜，被广泛用于固定于各种金属及氧化物表面。

基于巯基乙胺自组装膜的压电传感器主要是通过在qcm的电极上修饰一种自组装膜，利用亚砷酸根离子与寡聚核苷酸适配体的特异性结合来实现检测。由于硫-金体系的自组装分子层成膜容易，制备简单，稳定性和有序性高，所以利用巯基乙胺的巯基与金电极形成au-s化学键吸附于金电极表面，固定亚砷酸根离子，利用亚砷酸根离子与适配体结合导致的频率变化响应值进行砷(ⅲ)的检测。

技术实现要素：

本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种制作简单、成本低廉、抗干扰能力的强及灵敏度高的用于快速检测砷(ⅲ)的生物传感器。

本发明提供了一种生物传感器，具有这样的特征，包括：测定电极；以及测定溶液，其中，制备测定电极的方法如下：步骤一，取石英晶体微天平(quartzcrystalmicrobalance，qcm)晶片，用第一溶液处理qcm晶片表面2～5min；步骤二，清洗经过步骤一处理的qcm晶片，并干燥qcm晶片；步骤三，将干燥后的qcm晶片浸泡于第二溶液中，置于密闭容器中常温避光反应第一时间；步骤四，将经过步骤三处理过的qcm晶片放入第三溶液中，置于密闭容器中常温避光反应第二时间；步骤五，清洗经过步骤四处理的qcm晶片，并干燥qcm晶片，得到的qcm晶片即为测定电极，制备测定溶液的方法如下：第一步骤，将四氯金酸加热至沸腾，迅速加入柠檬酸二钠溶液，加热第三时间之后冷却至室温，制得纳米金溶液；

第二步骤，将纳米金溶液与巯基修饰的寡聚核苷酸适配体按照第一摩尔比混合反应第四时间，再加入tris-hcl(ph7.4)缓冲液，放置24h；第三步骤，将经过第二步骤得到的溶液在离心机上以第一离心速度离心30min获得沉淀物，使用hepes(ph7.4)缓冲液清洗沉淀物数次，最后将获得的沉淀物分散于hepes(ph7.4)溶液中，得到的溶液即为测定溶液。

在本发明提供的一种生物传感器中，还可以具有这样的特征：其中，第一溶液为食人鱼溶液(浓h2s04:30％h202＝3：1，v/v)。

在本发明提供的一种生物传感器中，还可以具有这样的特征：其中，第二溶液为巯基乙胺溶液，第三溶液为6-巯基己醇。

在本发明提供的一种生物传感器中，还可以具有这样的特征：其中，第一时间的范围为8～14h，第二时间的范围为0.5～4h。

在本发明提供的一种生物传感器中，还可以具有这样的特征：其中，第三时间的范围为10～30min，第四时间的范围为12～48h。

在本发明提供的一种生物传感器中，还可以具有这样的特征：其中，第一摩尔比的范围为1:50～1:150。

在本发明提供的一种生物传感器中，还可以具有这样的特征：其中，纳米金溶液中金粒子的平均粒径为12±3nm。

在本发明提供的一种生物传感器中，还可以具有这样的特征：其中，第一离心速度的范围为12000～16000r/min。

发明的作用与效果

根据本发明所涉及的一种生物传感器，因为设计合理，所以本发明的一种生物传感器具有检测灵敏度高、特异性强，可以实现对砷(ⅲ)的高效快速检测，且操作简单、成本低廉。

附图说明

图1是本发明提供的一种生物传感器的原理示意图；

图2是本发明提供的一种生物传感器中的测定电极的频率变化δf与砷(ⅲ)浓度的关系图；

图3是测定电极的频率变化△f与砷(ⅲ)浓度的回归方程；以及

图4为干扰离子引起的频率变化与空白频率变化的差值。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下实施例结合附图对本发明提供的一种生物传感器作具体阐述。

图1是本发明提供的一种生物传感器的原理示意图。

如图1所示，本发明以石英晶体微天平(qcm)金电极，巯基乙胺自组装分子膜以及纳米金标记的砷(ⅲ)寡聚核苷酸适配体联合构建了砷(ⅲ)的检测体系：当待测样品中没有砷(ⅲ)时，纳米金标记的寡聚核苷酸适配体无法与巯基乙胺分子膜连接，电极表面质量变化不明显，频率变化不显著；当待测样品中含有砷(ⅲ)时，金电极表面的巯基乙胺自组装分子层充分捕捉亚砷(ⅲ)酸根离子，进而通过寡聚核苷酸适配体与亚砷(ⅲ)酸根离子之间的高度特异性亲和力，将纳米金标记的寡聚核苷酸适配体连接固定于qcm金电极表面，令电极表面质量显著增加，qcm金电极晶振片的响应频率发生明显变化。因此通过确定电极的频率信号变化能够实现亚砷(ⅲ)酸盐的定量检测，其中qcm电极的频率信号变化与亚砷(ⅲ)酸盐浓度成正比。

本发明提供了一种生物传感器，用于高效快速地检测待测溶液中的砷(ⅲ)，包括：测定电极，用于检测待测溶液中的砷(ⅲ)；以及测定溶液，用于辅助测定电极检测待测溶液中的砷(ⅲ)。

其中，测定电极的制备过程如下：

步骤一，取双面镀金的石英晶体微天平(quartzcrystalmicrobalance，qcm)晶片，用食人鱼溶液(浓h2s0430％h202二3：1，v/v)处理qcm晶片表面5min；

步骤二，用超纯水清洗经过步骤一处理的qcm晶片，直至彻底去除残留在qcm晶片表面的食人鱼残留液，再用n2吹干qcm晶片；

步骤三，将qcm晶片浸泡于巯基乙胺溶液中，置于密闭容器中常温避光反应12h，qcm晶片完成自组装；

步骤四，将经过步骤三处理过的qcm晶片放入6-巯基己醇溶液中，置于密闭容器中常温避光反应2h，以封闭qcm晶片表面的非特异性结合位点；

步骤五，用超纯水清洗经过步骤四处理的qcm晶片，再用n2吹干qcm晶片，得到的qcm晶片即为测定电极，于4℃保存备用。

测定溶液的制备过程如下：

第一步骤，将50ml的四氯金酸(1mm)加热至沸腾，迅速加入5ml的柠檬酸二钠溶液(38.8mm)，加热15min之后冷却至室温，制得纳米金溶液，纳米金溶液的最大吸收波长为520nm，消光系数ξ＝2.43*10⁸，得出其浓度为11nm，粒径大小为12±3nm。

第二步骤，将纳米金溶液与巯基修饰的寡聚核苷酸适配体(序列为：5’-sh-ggtaatacgactcactatagggagataccagcttattcaattttacagaacaaccaacgtcgctccgggtacttcttcatcgagatagtaagtgcaatct-3’)按照1:130摩尔比混合反应24h，再加入ph7.4tris-hcl(0.1mnacl,10mmtris-hcl)放置24h，使寡聚核苷酸适配体在纳米金表面呈线性排列。

第三步骤，将第二步骤得到的溶液在离心机上以14000r/min的速度离心30min获得沉淀物，再使用ph7.4hepes缓冲(25mmhepes，0.1mnacl)溶液清洗5次，最后将获得的沉淀物分散于ph7.4的hepes(25mm，0.1mnacl))缓冲溶液中，4℃保存备用。

利用本发明提供的生物传感器检测待测溶液中的砷(ⅲ)的检测方法如下：

s1，利用完成自组装的测定电极在qcm检测其频率，记做f0；

s2，在qcm上检测了频率f0之后的测定电极上滴加20μl一定浓度的亚砷(ⅲ)酸盐溶液，反应30min，令亚砷(ⅲ)酸根离子被充分捕捉固定于电极表面，经双蒸水冲洗、氮气吹干，再滴加20μl测定溶液，反应30min后，测定溶液中的纳米金标记的寡聚核苷酸适配体与测定电极上固定的亚砷(ⅲ)酸根离子结合，将纳米金及寡聚核苷酸适配体牢固吸附于测定电极表面，双蒸水冲洗干净、氮气吹干，利用qcm检测测定电极的频率，记做f1；

s3，重复以上s1、s2，获得一系列不同浓度的亚砷(ⅲ)酸盐溶液对应的测定电极的频率变化△f，计算△f＝f0-f1，并以不同浓度的亚砷(ⅲ)酸根离子与对应的频率变化作图，绘制标准曲线，如图2所示。

图3是取图2中的三个点得出的亚砷(ⅲ)酸根离子的浓度与测定电极的频率变化△f的回归方程：△f＝0.2398cas+9.2754，其中：△f为频率变化，单位为hz，cas是亚砷(ⅲ)酸根离子浓度，单位为nm。

s4，将待测溶液按s1、s2测试其△f；比照标回归方程得出待测溶液中的砷(ⅲ)离子浓度。

本检测方法测定砷(ⅲ)的浓度范围为0-200nm，最低检测限为4.5nm。

图4为干扰离子引起的频率变化与空白频率变化的差值。

如图4所示，为检测本发明提供的生物传感器对砷(ⅲ)离子检测的特异性，分别制备浓度为10μm汞(ⅱ)、铅(ⅱ)、镉(ⅱ)、铜(ⅱ)、砷(ⅴ)的离子溶液，利用本发明的测定方法检测其频率变化，并与浓度为1μm的砷(ⅲ)离子溶液进行比较。结果表明，浓度为10μm的汞(ⅱ)、铅(ⅱ)、镉(ⅱ)、铜(ⅱ)、砷(ⅴ)离子溶液对测定体系的频率变化都明显小于1μm砷(ⅲ)离子溶液对测定体系的频率变化，而含有1μm砷(ⅲ)离子和10μm上述五种离子的混合溶液对测定体系的频率变化与1μm砷(ⅲ)离子溶液对测定体系的频率变化基本一致，从而表明本发明的生物传感器对砷(iii)离子具有特异性。

实施例的作用与效果

根据本发明所涉及的一种生物传感器，因为设计合理，所以本发明的一种生物传感器具有检测灵敏度高、特异性强，可以实现对砷(ⅲ)的高效快速检测，且操作简单、成本低廉。

上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。