添加有游离氨基酸的饲料中游离氨基酸的检测方法与流程

本发明涉及食品领域，具体地，本发明涉及添加有游离氨基酸的饲料中游离氨基酸的检测方法，更具体地，本发明涉及饲料提取液的制备方法以及检测饲料游离氨基酸的方法。

背景技术：

饲料中氨基酸的检测方法目前是以国家标准《gb/t18246-2000饲料中氨基酸的测定》为主，但是该标准方法中前处理方法操作步骤比较繁琐。

因此，步骤简便、可操作性强、检测效果好的测定方法还需进一步研究。

技术实现要素：

本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：

发明人发现，国标方法《gb/t18246-2000饲料中氨基酸的测定》中记载的酸提取法不仅存在赖氨酸不能测准的问题，而且该方法的灵敏度很低，氨基酸含量在2.0％以上时才能够测出。

基于上述问题，发明人通过无数次的实验摸索后进一步发现，原因在于以下几个方面：其一，国标方法在提取过程中，样品浑浊，过滤速度太慢，特别是在测定赖氨酸时，预混料和浓缩饲料基质会有较大干扰，从而严重影响检测结果的准确性；其二，由于预混料和浓缩饲料基质成分复杂，因此，国标方法用稀盐酸进行了两次提取。而提取液合并后溶液体积又不能减少，由此，国标方法必须在步骤的最后将待测液定容至100ml，从而将样品稀释了100倍，导致国标方法的灵敏度大大降低。

最终，发明人通过改变提取试剂的种类及浓度，即用10％的磺基水杨酸溶液代替0.1mol/l的hcl溶液，同时配合震荡、超声以及离心处理，克服了上述问题，进而，相比现有技术，本发明检测方法的灵敏度大大提高，氨基酸含量在0.5％即可测出，并且能够准确测定各氨基酸(包括赖氨酸)的含量。另外，由于提取试剂(磺基水杨酸)的化学结构与氨基酸分析仪的分离柱内填料(填料为3μm磺酸型阳离子树脂)特性相近，使仪器的色谱柱寿命得到了很好的延续，柱效更高。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种饲料提取液的制备方法，所述饲料中添加有游离氨基酸。根据本发明的实施例，所述方法包括：

(1)将1.0～2.0g待测饲料以及20ml10％的磺基水杨酸溶液置于离心管中依次进行10min的震荡处理以及3～5min的超声处理；

(2)将超声处理产物在4000r/min的条件下进行5min的离心处理，以便获得上清液，所述上清液为所述提取液。

在制备添加有游离氨基酸的饲料提取液的方法中，发明人发现，提取试剂的浓度与最终样品中添加的氨基酸的检测结果关系很大，若提取试剂磺基水杨酸溶液的浓度过高，会破坏待测氨基酸的结构，导致本发明检测方法的准确度和灵敏度降低；若提取试剂磺基水杨酸溶液的浓度过低，则提取不充分，导致本发明检测方法的灵敏度和准确度降低。采用根据本发明实施例的提取方法使本发明的检测方法与现有技术相比，灵敏度大大提高，氨基酸含量在0.5％即可测出，并且能够准确测定各氨基酸(包括赖氨酸)的含量。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种饲料提取液的制备方法，所述饲料中添加有游离氨基酸。根据本发明的实施例，所述方法包括：

(1)将待测饲料以及10％的磺基水杨酸溶液置于离心管中依次进行震荡处理以及超声处理；

(2)将超声处理产物进行离心处理，以便获得上清液，所述上清液为所述提取液。

发明人发现，采用根据本发明实施例的提取方法使本发明的检测方法与现有技术相比，灵敏度大大提高，氨基酸含量在0.5％即可测出，并且能够准确测定各氨基酸(包括赖氨酸)的含量。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述震荡处理的时间为10min，所述超声处理的时间为3～5min，所述离心处理是在4000r/min的条件下进行5min。发明人发现，上述条件下提取更充分，进而，后续的检测效果更好。

根据本发明的实施例，所述待测饲料为1.0～2.0g，所述10％的磺基水杨酸溶液的体积为20ml。发明人发现，上述各含量与提取步骤相互配合，进而，后续的检测效果更好。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测饲料中游离氨基酸的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：

利用上述任一项所述的方法获得提取液；以及

基于所述提取液进行检测，以便获得所述饲料中添加的游离氨基酸的种类及含量。

根据本发明实施例的检测方法步骤简便、易懂，可操作性强，同时相比现有技术，灵敏度大大提高，氨基酸含量在0.5％即可测出，并且能够准确测定各氨基酸(包括赖氨酸)的含量。

根据本发明的实施例，上述方法还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述检测是通过氨基酸分析仪进行的。发明人发现，采用氨基酸分析仪进行检测，检测效果更好，仪器检出限达到3pmol/ul。

根据本发明的实施例，所述氨基酸分析仪采用na+交换柱，柱温为135℃。发明人发现，氨基酸分析仪采用该条件时，检测效果更好。

根据本发明的实施例，所述氨基酸分析仪的分离柱内填料为3μm磺酸型阳离子树脂。发明人发现，磺基水杨酸作为提取试剂时，其化学结构与氨基酸分析仪的分离柱内填料(填料为3μm磺酸型阳离子树脂)特性相近，可以使仪器的色谱柱寿命得到很好的延续，柱效更高。

附图说明

图1是根据本发明实施例的氨基酸混合标准液的上机检测图谱示意图；

图2是根据本发明实施例的检测方法对饲料样品中添加游离氨基酸进行检测获得的上机检测图谱示意图；以及

图3是根据国标方法对饲料样品中添加游离氨基酸进行检测获得的上机检测图谱示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，本发明的提取方法和检测方法适用于配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料、单一饲料和预混料中添加的游离氨基酸的提取和测定。

需要说明的是，如无特别说明，本申请所述的“游离氨基酸”是指外源添加到饲料样品中的氨基酸，如本申请的检测方法所能测定出的17种游离氨基酸，即天门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸以及脯氨酸。

本方法适用于游离氨基酸的测定，特别适合样品中人为添加各种氨基酸的测定，主要是针对添加剂预混合饲料进行的针对性的氨基酸实验，可以保证添加营养物氨基酸理论与实际成本相符合，达到理想的添加剂预混合饲料，保证产品质量。

实施例1

饲料中氨基酸含量的检测方法如下：

1)酸提取法：样品(添加理论含量为0.5g/100g的游离氨基酸的预混料饲料)通过10％的磺基水杨酸溶液溶解、超声、震荡、离心等提取后，上清液经0.22um滤膜过滤，待用，直接机上测定。

2)取氨基酸混合标液0.4ml(日本味之素公司生产，含量5ml)，用0.02mol/l盐酸溶液溶解并定容至10ml，即配制成2nmol/20ul氨基酸混合标准工作液(其中只有脯氨酸为4nmol/20ul)，作为上机测定用，检测图谱示意图参见图1。用日立l-8900型氨基酸自动分析仪以外标法(用已知不同含量的氨基酸标样系列等量进样分析，然后做出响应信号与含量之间的关系曲线，在测校正曲线相同条件下进等量的待测样品，由仪器自动算出样品的含量)检测待测样品中各氨基酸的含量。

3)氨基酸全自动仪上机测定采用na+交换柱分离，柱温135℃，按仪器说明书要求配制标准分析用ph1、ph2、ph3、ph4、ph6洗脱溶液和茚三酮溶液以及茚三酮缓冲液。进行梯度洗脱，采用多反应监测方式进行定量，仪器检出限达到3pmol/ul。

上述所述的步骤1)中所述样品的处理方法如下：

d)样品(添加理论含量为0.5g/100g的游离氨基酸的预混料饲料)(1.0-2.0g)加入离心管中，加入20ml的10％的磺基水杨酸溶液，震荡仪震荡10min、超声3-5min、离心5min(4000r/min)，上清液经0.22um滤膜过滤，待用。

e)准确配制标准溶液浓度为2.00nmol/20ul，作为上机测定用，用氨基酸自动分析仪以外标法测定试样测定液的氨基酸含量。

检测结果如下：

本发明方法获得的检测图谱示意图参见图2。国标法获得的检测图谱示意图参见图3。

本发明检测方法与国标法对实施例1中同一饲料样品中添加游离氨基酸含量及种类的检测结果对比见下表1。

表1：本发明检测方法与国标法对实施例1中同一饲料样品中添加游离氨基酸含量及种类的检测结果对比

由上表1分析可知，本发明检测方法与国标法相比，准确度大大提高，且检测种类很全面。本发明的检测方法步骤简便、易懂，可操作性强，同时相比现有的国标方法，准确性、精密度和回收率大大提高，本发明检测方法的回收率在73.06-127.26％之间，而国标法的回收率在40.26～79.68％之间，并且本发明检测方法能够一次性准确测定包括赖氨酸等在内的17种水解氨基酸的含量。

对比例1

检测方法与实施例1的区别仅在于：所测样品为添加了理论含量为1.0g/100g的游离氨基酸的普通预混料饲料，提取试剂为15％的磺基水杨酸。检测结果如下表2所示。

表2：对比例1中15％的磺基水杨酸提取的检测结果列表

由上表2结果可以看出，前处理过程中，加标样品若用15％的磺基水杨酸溶液进行提取，由于提取试剂浓度太高，对部分氨基酸会造成结果异常，回收率范围为47.19-98.09％。其中，对中性氨基酸和碱性氨基酸会有很大影响，特别是对于赖氨酸，因其属于碱性氨基酸，所以结果严重偏低，准确性大大降低，不过对酸性氨基酸影响不大。

结论：15％的磺基水杨酸溶液作为添加游离氨基酸的样品的提取试剂，会导致个别氨基酸测定结果严重不准确，同时其余氨基酸测定结果的准确度和回收率也大大降低。

对比例2

检测方法与实施例1的区别仅在于：所测样品为添加了理论含量为1.0g/100g的游离氨基酸的普通预混料饲料，提取试剂为5％的磺基水杨酸。检测结果如下表3所示。

表3：对比例2中5％的磺基水杨酸提取的检测结果列表

由上表3结果可以看出，前处理过程中，加标样品若用5％的磺基水杨酸溶液进行提取，由于提取试剂浓度太低，对部分氨基酸同样会造成结果异常，回收率范围在33.63-89.69％。其中，对酸性氨基酸和碱性氨基酸会有很大影响，特别是对于赖氨酸，因其属于碱性氨基酸，所以结果严重偏低，准确性大大降低。但对中性氨基酸影响不大。

结论：5％的磺基水杨酸溶液作为添加游离氨基酸的样品的提取试剂，会导致个别氨基酸测定结果严重不准确，同时其余氨基酸测定结果的准确度和回收率也大大降低。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。