一种基于NMR技术快速定量臭氧化油活性组分的方法与流程

本发明属于精细化学品领域，涉及一种基于核磁共振(nmr)技术快速定量分析臭氧化油组分的方法。

背景技术：

20世纪70年代美国首先采用臭氧作为废水预处理的重要组成部分。如今，随着科学技术突飞猛进的发展，在国际上臭氧技术的研究及应用己形成独立的产业，具有十分广阔发展前景。

医用臭氧作为杀菌剂、抗病毒剂和细胞活性调节物质，近几年来发展很快。其中，液态臭氧化油作为臭氧的储存池(橄榄油、葵花籽油、大豆油及其它植物油则是臭氧常用的赋形剂)，可以缓慢释放臭氧或其它活性物质。医用臭氧化油的应用从最初的治疗腰椎间盘突出，发展到治疗如骨关节病、病毒性肝炎、疼痛、溃疡病、妇科炎症、脑梗塞、避孕药剂等多种疾病，其作为皮肤外用的杀菌、抗菌剂方面也有着广泛的应用。

目前，臭氧化油中氧化性物质含量的测定采用的是碘量法。即在酸性条件下，加入过量饱和碘化钾溶液，与臭氧化油中氧化性物质反应，再用硫代硫酸钠标准反应溶液滴定，最后计算得到氧化性物质。该方法利用还原性溶液与臭氧化油中所有的氧化性产物反应，即氧化还原反应定量给出氧化值。该方法对臭氧化油中的o2、o3，和其它过氧化物质等并没有选择性，即测定的是所有氧化性物质。而实际上臭氧化油中溶解的o2、o3等气体组分非常容易逸出；而部分过氧化物的稳定性又比较差，因此该方法用于臭氧化油的质量控制时存在非常明显的局限性。为了满足臭氧化油中活性组分的含量测定和质量控制，开发新的快速检测臭氧化油中活性组分的方法是非常必要的。

nmr定量分析(qnmr)方法起步较晚，但是发展很快。qnmr的优点在于整个分析过程中无需引入校正因子，定量结果不受样品中其它杂质含量的影响。随着核磁共振技术的快速发展和日益成熟，核磁定量分析方法的准确度、灵敏度、专属性及分析速度等方面已达到或接近hplc的水平，中日欧美等药典中均收载此法。但目前尚未见到利用qnmr技术一步测定臭氧化油中活性组分的相对摩尔含量的方法报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于nmr技术快速定量臭氧化油活性组分的方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于nmr技术快速定量臭氧化油活性组分的方法，包括以下步骤：

1)将臭氧化油样品溶解于氘代试剂，得分析样品，然后将分析样品转移至核磁管(核磁管例如选自外径为1.7mm、2.1mm或5mm的石英或高硼硅核磁管)；

2)基于nmr定量分析，采用nmr并利用碳共振频率对核磁管中的分析样品进行检测；

3)根据检测得到的碳共振信号，选取臭氧化油活性组分的特征信号峰(例如，δ104ppm、δ43ppm、δ202ppm)及制备臭氧化油的原料油中的双键对应的特征信号峰(例如，δ129ppm)，然后用相对峰高定量计算臭氧化油活性组分的含量，所述臭氧化油活性组分选自臭氧化油中的过氧化物(例如，环氧化合物)、醛类或其它具有氧化特性的组分中的一种或多种。

优选的，所述臭氧化油样品选自臭氧化油原料、臭氧化油复方制剂或其他经臭氧化反应制备的臭氧化油；臭氧化油样品溶解中，臭氧化油样品的用量为1～200mg。

优选的，所述氘代试剂选自cdcl3、dmso-d6、cd3od、acetone-d6、thf-d8、dmso-d6、benzene-d6、toluene-d8、pyridine-d5或acetonitrile-d3；臭氧化油样品溶解中，氘代试剂的用量为0.2～1ml。

优选的，所述nmr的检测条件为：采用13c的共振频率，脉冲序列的角度为30～90度，弛豫时间≥5s，扫描次数为32～8192次，探头温度为20～40℃，谱峰宽度≤219ppm。

优选的，所述臭氧化油活性组分的含量按照以下公式计算：

m活＝(h202+h104+h43)/(h202+h104+h43+h129)

其中，m活为臭氧化油活性组分的摩尔分数；h202、h104及h43为臭氧化油活性组分的特征信号峰δ202ppm、δ104ppm及δ43ppm的峰高；h129为所述原料油中双键对应的信号峰δ129ppm的峰高。

上述基于nmr技术快速定量臭氧化油活性组分的方法在臭氧化油或其制剂的质量控制或抗菌活性评价中的应用。

本发明的有益效果体现在：

本发明采用nmr测定臭氧化油活性组分的碳共振频率，利用nmr可以对化合物中不同官能团进行定性和定量的特点，根据样品中活性组分和原料成分的化学结构特征进行定量分析，能够在未知臭氧化油或其混合物的摩尔分子量的情况下快速、准确的给出活性组分的相对摩尔含量，解决了臭氧化油中活性组分的快速、准确定量分析的问题，有利于臭氧化油的质量控制；本发明具有操作简单，快速批量实现，实验重现性好，实验数据直观可靠等特点，特别适用于微量样品的检测，为臭氧化油或其复方制剂的研究提供了一条快速定量的思路和方法。

进一步的，本发明通过原料特征信号峰和活性组分的特征信号峰的峰面积比值来定量分析臭氧化油样品，所采用的特征信号峰(通过分析大量的臭氧化油指纹图谱数据而确定的)不重叠、不干扰，确保了nmr定量分析可以有效应用于臭氧化油活性成分快速定量检测。

进一步的，本发明通过优化脉冲序列中的角度、弛豫时间、扫描次数、探头温度等参数，使得本发明对不同来源、不同工艺条件、不同质量标准的臭氧化油或其制剂的活性组分的定量具有较强的适用性，消除了信号峰飘移对定量结果的影响，使活性组分定量更为灵活、更为准确。

另外，本发明在结合nmr的自动进样器后，可以实现无人值守的快速定量，节省人力、物力。

附图说明

图1是以橄榄油为原料制备的臭氧化油的¹³cnmr图谱。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

(一)臭氧化油中活性组分的定量分析

实施例1以橄榄油为原料制备的臭氧化油中活性组分的定量分析

该臭氧化油(西安金品正德生物科技有限公司)作为原料用于皮肤消毒、辅助治疗痤疮、粉刺等的制剂中。

(1)定量分析步骤和结果

取臭氧化油100mg溶于0.4ml氘代氯仿(cdcl3)，转移至5mm标准核磁管，bruker400mhz测定样品的碳共振信号，探头温控24℃，调用脉冲序列zgpg30(90度脉冲角度)，重新定义弛豫时间d1＝5s，扫描次数ns＝1024；其他参数为序列中的标准参数(例如，谱峰宽度为219ppm)，topspin3.5采集数据。¹³cnmr(cdcl3100mhz，图1)检测特征信号δppm：202、129、104、43，其中，臭氧化油中活性组分的定性采用δ202ppm、104ppm及43ppm的峰，对于原料中的双键采用δ129的单峰：

m活＝(h202+h104+h43)/(h202+h104+h43+h129)(1)

根据公式(1)计算活性组分的摩尔分数(m活)为14.3％，h为信号峰的峰高。

(2)精密度、重现性及稳定性实验

1.精密度实验：取样品1份，按照上述方法连续采样5次，自动积分，对峰进行分析，其化学位移和相对峰面积的rsd分别在0-0.08％和0.25％-0.98％之间，说明该方法精密度良好。

2.重现性实验：取同一批次的样品5份，按照上述方法采样5次。自动积分，对峰进行分析，其化学位移和相对峰面积的rsd分别在0-0.13％和0.22％-1.22％之间，说明该方法重现性良好。

3.稳定性实验：取样品1份，分别在0、2、8、16、24、48h采样测定，自动积分，对峰进行分析，其化学位移和相对峰面积的rsd均小于1.5％，说明该方法在48h内测定是稳定的。

实施例2以大豆油为原料制备的臭氧化油中活性组分的定量分析

该臭氧化油(陕西康乐)作为原料用于治疗妇科炎症的制剂中。除以下条件外，其它条件与实施例1相同：

取臭氧化油2mg溶于0.3mldmso-d6，转移至2.1mm标准核磁管；

探头温控40℃，扫描次数ns＝8192。

根据公式(1)计算活性组分的摩尔分数为7.4％。

(2)精密度、重现性及稳定性实验与实施例1相似，均符合方法学的验证标准。

(二)臭氧化油的体外抗菌实验

参考文献方法，平行3次，简述如下：采用液体培养基试管连续稀释法测定臭氧化油的最小抑菌浓度，吐温-80助溶，无菌培养管中加入100μl菌液，逐级稀释至9号瓶；37℃温箱中培养24h。无细菌生长的培养基清亮，以未见细菌生长为药物(臭氧化油)的最低抑菌浓度(mic)。参见表1，臭氧化油1和臭氧化油2分别为实施例1和实施例2中的医用臭氧化油产品。

表1臭氧化油1和2的最低抑菌浓度

参见表1，臭氧化油的抗菌活性与本发明中活性组分检测结果正相关，而与现有的碘量法测量结果不相关。

以上实施例1-2并不是本发明可以实施的全部实施例，本发明所针对的是臭氧化油或其复方中具有特征结构的一种或多种化合物，根据其cnmr共有的特征信号来定量分析，不同的臭氧化油中活性组分的化合物类型不同，导致分析检测条件不相同，据此得出本发明中的条件范围。

本发明选择nmr技术对臭氧化油或复方中的活性成分含量进行检测，是为了解决在实际生产、科研中臭氧化油活性组分的定量不准确，质量控制困难等问题，对各种臭氧化油原料、臭氧化油复方制剂或其它经臭氧化反应制备的臭氧化油均可快速定量分析，给出活性成分的相对摩尔含量。具有操作简单，快速批量实现，实验重现性好，实验数据直观可靠，应用性广等特点，特别适用于微量样品的检测；为臭氧化油或其复方制剂的研究提供了一条快速定量的思路和方法。