一种用于测定多黏菌素类抗菌肽的毛细管电泳方法及其运行缓冲液与流程

本发明属于分析化学领域，尤其涉及一种用于测定多黏菌素类抗菌肽的毛细管电泳方法以及该毛细管电泳方法中使用的运行缓冲液。

背景技术

多黏菌素为脂肽类抗菌肽，对革兰氏阴性杆菌有强效杀菌作用，而由于多黏菌素类抗菌肽具有较大的肾毒性及神经毒性，目前用于临床上的大多数为多黏菌素b、e，被认为是治疗多重耐药革兰阴性杆菌感染的“最后一道防线”。由于是发酵产物，多黏菌素b或e均是一系列结构类似多肽的混合物，多黏菌素b主要组分为多黏菌素b1、b2、b3及b1-i，结构式见附图1，多黏菌素e主要组分为多黏菌素e1、e2，结构式见附图2。多黏菌素b1、b2与e1、e2的差别仅在于环肽上的氨基酸d-phe变为d-leu。目前，中国药典(chp)2015年版、美国药典(usp)40版、欧洲药典(ep)9.0版均采用液相色谱法分析多黏菌素b、e中的组分及有关物质，通过相对保留时间对主要组分进行定性分析，主峰峰型较宽。govaerts及hoogmartens等人开发了液质联用方法分析了多黏菌素b、e中有关物质的结构(talanta,2011,83(5):1521-1529)。毛细管电泳方法对于复杂体系具有较好的分离效果，是液相色谱良好的正交补充方法。kang等人选择甲基-β-环糊精作为添加剂，建立了多黏菌素b、e的毛细管电泳定性定量方法(journalofchromatographya，879(2000)，211–218；electrophoresis，21(2000)，3199-3204)，但采用该方法分析国产注射用硫酸多黏菌素b时，发现多黏菌素b1与相邻杂质的分离度较差。

因此，急需一种能够实现多黏菌素分离且操作简单的方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术中多黏菌素类抗菌肽分离效果差、柱效低等问题，本发明提供一种简单、灵敏，适合多黏菌素类抗菌肽组分及有关物质分析的毛细管电泳方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种基于毛细管电泳的用于测定多黏菌素类抗菌肽的运行缓冲液，该运行缓冲液为含羟丙基类环糊精、有机溶剂的三乙醇胺溶液或三乙胺溶液。

为了进一步优化上述运行缓冲液，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述羟丙基类环糊精包括羟丙基-β-环糊精、羟丙基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精、和/或其硫酸化环糊精和/或磺酸化环糊精，也可包括其他具有类似性质的环糊精；所述有机溶剂包括异丙醇、乙腈和/或甲醇，也可包括其他具有类型性质的有机溶剂。

进一步地，所述环糊精的浓度为5mmol/l-50mmol/l，所述有机溶剂的含量为1％-10％(v/v)，所述三乙醇胺溶液或三乙胺溶液的浓度为80-160mmol/l；其中所述三乙醇胺溶液或三乙胺溶液的ph经酸溶液调整至2-4，所述酸溶液选自甲酸、磷酸、盐酸及硫酸中的一种，也可为其他具有ph调节特性的酸性溶液，优选为磷酸。

进一步地，所述羟丙基类环糊精为羟丙基-β-环糊精，其浓度范围在5mmol/l-50mmol/l。在运行过程中进口缓冲液中含有羟丙基-β-环糊精，出口缓冲液中可以含有羟丙基-β-环糊精或不含有羟丙基-β-环糊精。

进一步地，所述有机溶剂为异丙醇，异丙醇含量在1％-10％(体积分数)，优选为5％(体积分数)。

进一步地，所述运行缓冲液为含羟丙基-β-环糊精、异丙醇的三乙醇胺溶。三乙醇胺浓度在80-160mmol/l，优选为130mmol/l，ph经酸溶液调整至2-4，ph优选为2.5。

本发明的第二个目的是提供一种测定多黏菌素类抗菌肽的毛细管电泳方法，其包括如下步骤：将多黏菌素类抗菌肽样品在溶剂中溶解后，直接在运行缓冲液中通过毛细管电泳测定多黏菌素类抗菌肽。

为了进一步优化上述毛细管电泳方法，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述多黏菌素类抗菌肽，是由多黏类芽孢杆菌或其他相关属种发酵产生及化学合成的多黏菌素b(polymyxinb)或e(polymyxine或colistin)，但不限于以上组分，也包括其他组分如多黏菌素a、c、d、f、k、m、p、s、t等。

进一步地，所述多黏菌素类抗菌肽的测定包括主要成分和有关物质的测定，具体包括主要成分和有关物质的种类及其含量；其中，当所述多黏菌素类抗菌肽为多黏菌素b，其主要成分为多黏菌素b1、多黏菌素b2、多黏菌素b3及多黏菌素b1-i，有关物质包括多黏菌素b4、多黏菌素b5、多黏菌素b6、多黏菌素b2-i、多黏菌素b3-i、多黏菌素b丝氨酸取代物、多黏菌素b缬氨酸取代物、多黏菌素b双键化取代物等中的至少一种；当所述多黏菌素类抗菌肽为多黏菌素e，其主要成分为多黏菌素e1、多黏菌素e2，有关物质包括多黏菌素e3、多黏菌素e4、多黏菌素e7、多黏菌素e1-i、多黏菌素e2-i、多黏菌素e丝氨酸取代物、多黏菌素e缬氨酸取代物、多黏菌素e双键化取代物等中的至少一种。

进一步地，所述多黏菌素类抗菌肽样品包括含多黏菌素类抗菌肽的原料药、注射剂、软膏剂、固体剂等。

进一步地，所述多黏菌素类抗菌肽样品包括硫酸或磺酸类多黏菌素b原料药、多黏菌素b制剂(包括注射剂及软膏剂等制剂)，多黏菌素b的主要组分为多黏菌素b1、多黏菌素b2、多黏菌素b3及多黏菌素b1-i。

进一步地，所述多黏菌素类抗菌肽样品为硫酸或磺酸类多黏菌素e原料药、多黏菌素e制剂(包括注射剂及软膏剂等制剂)，多黏菌素e的主要组分为多黏菌素e1、多黏菌素e2。

进一步地，上述毛细管电泳方法中，溶剂包括但不限于水、乙腈、甲醇、异丙醇或以上不同比例的混合溶剂及缓冲液等。多黏菌素类抗菌肽溶解后的终浓度为0.1mg/ml-20mg/ml，优选浓度为2-5mg/ml。优选溶剂为水-乙腈＝80：20(体积比)。

进一步地，上述毛细管电泳方法中，该运行缓冲液为含羟丙基类环糊精、有机溶剂的三乙醇胺溶液或三乙胺溶液。

进一步地，上述毛细管电泳方法中，所述羟丙基类环糊精可为羟丙基-β-环糊精，也可以选择羟丙基-α-环糊精、羟丙基-γ-环糊精或硫酸化及磺酸化环糊精等；优选地，所述环糊精为羟丙基-β-环糊精，其浓度范围在5mmol/l-50mmol/l。在运行过程中进口缓冲液中含有羟丙基-β-环糊精，出口缓冲液中可以含有羟丙基-β-环糊精或不含有羟丙基-β-环糊精。

进一步地，上述毛细管电泳方法中，所述有机溶剂可为异丙醇，也可以选择乙腈、甲醇等；优选地，所述有机溶剂为异丙醇，异丙醇含量在1％-10％(体积分数)，优选为5％。

进一步地，上述毛细管电泳方法中，所述运行缓冲液为含羟丙基-β-环糊精和异丙醇的三乙醇胺溶液，也可以选择三乙胺溶液。三乙醇胺浓度在80-160mmol/l，优选为130mmol/l，ph经酸溶液调整至2-4，ph优选为2.5。

进一步地，上述毛细管电泳方法中，所述的酸溶液为甲酸、磷酸、盐酸及硫酸等，优选为磷酸。

进一步地，所述毛细管电泳方法中，分离毛细管为非涂层熔融石英毛细管，也可以选择适合于分离测定的涂层毛细管，如阳离子涂层毛细管、阴离子涂层毛细管、中性涂层毛细管等。

进一步地，所述毛细管长度在30-100cm，内径为25μm-100μm。毛细管优选为60cm长，50μm内径。

进一步地，所述毛细管电泳方法中，进样方式为压力进样：30mbar-50mbar，3-20s。优选为50mbar，5s。

进一步地，所述毛细管电泳方法中，分离电压采用10kv-30kv。优选为20-25kv。

进一步地，所述毛细管电泳方法中，检测波长选择范围为180-380nm，优选为192nm。

进一步地，所述毛细管电泳方法中，毛细管控制温度选择在20℃-40℃，优选为25℃-30℃。

与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果：

(1)在毛细管电泳方法中首次采用含羟丙基类环糊精、有机溶剂的三乙醇胺溶液或三乙胺溶液对多黏菌素类抗菌肽进行分析，组分及有关物质分离良好，尤其是多黏菌素b、多黏菌素e的分离和测定；

(2)与液相方法相比，柱效高，操作简单，样品及试剂消耗量极少，成本低；

(3)方法重复性好，对不同厂家的样品测定结果稳定可靠；

(4)适合于其他多黏菌素类抗菌肽组分及有关物质(如多黏菌素a、c、d、f、k、m、p、s、t等)的检测，易于推广。

本发明建立了适用于国产多黏菌素类抗菌肽组分及有关物质(包括相邻杂质)分析的毛细管电泳方法，尤其采用羟丙基-β-环糊精、异丙醇作为分离添加剂、三乙醇胺-磷酸为缓冲液。本发明中的毛细管电泳测定方法简单、灵敏，样品及试剂用量少，环境友好，适合于多黏菌素类抗菌肽的质量控制。

附图说明

图1为多黏菌素b主要组分的结构式。

图2为多黏菌素e主要组分的结构式。

图3为按本发明实施例5所述的方法对多黏菌素b的分离电泳图。

图4为按本发明实施例6所述的方法对多黏菌素e的分离电泳图。

图5为按现有技术中的方法对多黏菌素b的分离电泳图。

具体实施方式

本发明涉及一种基于毛细管电泳的用于测定多黏菌素类抗菌肽的运行缓冲液，所述运行缓冲液为含羟丙基类环糊精、有机溶剂的三乙醇胺溶液或三乙胺溶液；本发明还涉及一种测定多黏菌素类抗菌肽的毛细管电泳方法，其包括如下步骤：将多黏菌素类抗菌肽样品在溶剂中溶解后，直接在上述运行缓冲液中通过毛细管电泳测定多黏菌素类抗菌肽。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。本发明中涉及的多黏菌素类抗菌肽，以多黏菌素b与多黏菌素e为具体实施案例，但本发明也可以推广至其他抗菌肽如多黏菌素a、c、d、f、k、m、p、s、t等。

实施例1

本实施例为本发明一较佳的基于毛细管电泳的用于测定多黏菌素类抗菌肽的运行缓冲液。

在本实施例中，运行缓冲液为含羟丙基-β-环糊精、异丙醇的三乙醇胺溶液；其中，在该缓冲液中，羟丙基-β-环糊精的浓度为30mmol/l，异丙醇含量为5％(体积分数)，三乙醇胺浓度为130mmol/l，ph经磷酸调整至2.5。

该运行缓冲液的毛细管电泳实验条件为：非涂层熔融石英毛细管，柱长为60cm，内径为50μm；工作电压24kv；柱温25℃；检测波长192nm；进样压力50mbar，进样时间3s。

实施例2

本实施例为本发明一较佳的基于毛细管电泳的用于测定多黏菌素类抗菌肽的运行缓冲液。

在本实施例中，运行缓冲液为含羟丙基-β-环糊精、异丙醇的三乙醇胺溶液；其中，在该缓冲液中，羟丙基-β-环糊精的浓度为50mmol/l，异丙醇含量为10％(体积分数)，三乙醇胺浓度为100mmol/l，ph经硫酸调整至3。

该运行缓冲液的毛细管电泳实验条件为：阳离子涂层毛细管，柱长为100cm，内径为100μm；工作电压20kv；柱温30℃；检测波长180nm；进样压力30mbar，进样时间5s。

实施例3

本实施例为本发明一较佳的基于毛细管电泳的用于测定多黏菌素类抗菌肽的运行缓冲液。

在本实施例中，运行缓冲液为含羟丙基-α-环糊精、乙腈的三乙醇胺溶液；其中，在该缓冲液中，羟丙基-α-环糊精的浓度为5mmol/l，乙腈含量为8％(体积分数)，三乙醇胺浓度为80mmol/l，ph经盐酸调整至2。

该运行缓冲液的毛细管电泳实验条件为：阴离子涂层毛细管，柱长为30cm，内径为25μm；工作电压10kv；柱温40℃；检测波长380nm；进样压力40mbar，进样时间10s。

实施例4

本实施例为本发明一较佳的基于毛细管电泳的用于测定多黏菌素类抗菌肽的运行缓冲液。

在本实施例中，运行缓冲液为含硫酸化环糊精、甲醇的三乙胺溶液；其中，在该缓冲液中，硫酸化环糊精的浓度为20mmol/l，甲醇含量为1％(体积分数)，三乙胺溶液为160mmol/l，ph经甲酸调整至4。

该运行缓冲液的毛细管电泳实验条件为：阴离子涂层毛细管，柱长为80cm，内径为75μm；工作电压30kv；柱温20℃；检测波长254nm；进样压力45mbar，进样时间20s。

经过实验验证，上述实施例1～实施例4中的运行缓冲液和毛细管电泳实验条件均适用于多黏菌素类抗菌肽组分及相关物质的测定，但采用实施例1中的运行缓冲液和毛细管电泳实验条件，测定效果更佳。

实施例5

本实施例为本发明一较佳的一种测定多黏菌素类抗菌肽的毛细管电泳方法，其采用实施例1所述的运行缓冲液和毛细管电泳实验条件，其测定的多黏菌素类抗菌肽为多黏菌素b。

一、仪器与实验条件

美国agilenttechnologies公司g1600ax型或7100型高效毛细管电泳仪。熔融石英毛细管(柱长为60cm，有效柱长为51.5cm，内径为50μm，河北永年光导纤维厂)。毛细管初次使用时，依次用1mol/l氢氧化钠溶液冲洗20min，1mol/l盐酸溶液及蒸馏水冲洗5min，再用运行缓冲液冲洗平衡20min。每次分析后用0.1mol/l氢氧化钠溶液、蒸馏水及运行缓冲液冲洗3min。

运行缓冲液：130mmol/l三乙醇胺溶液用磷酸调节ph值至2.5，加入5％(v:v)异丙醇与30mmol/lhp-β-cd，出口缓冲液瓶中可以含有hp-β-cd，也可以不含有hp-β-cd。

工作电压24kv；柱温25℃；检测波长192nm；进样压力50mbar，进样时间3s。

二、多黏菌素b样品溶液配制及分析

多黏菌素b主要组分b1、b2、b3及b1-i的结构式见图1。精密称取硫酸多黏菌素b制剂50mg置10ml量瓶中，加溶剂(水-乙腈＝80:20)溶解，定容，摇匀，作为供试品溶液，临用现制。直接按照仪器与实验条件中进行分析，出口缓冲液瓶中不含hp-β-cd，见图3，图中标识出主要组分b1、b2、b3及b1-i，主要组分与相邻有关物质均实现了较好的分离，适合于定性定量分析。

实施例6

本实施例为本发明一较佳的一种测定多黏菌素类抗菌肽的毛细管电泳方法，其采用如实施例1所述的运行缓冲液和毛细管电泳实验条件，其测定的多黏菌素类抗菌肽为多黏菌素e。

多黏菌素e主要组分e1、e2的结构式见图1。精密称取硫酸多黏菌素e制剂50mg置10ml量瓶中，加溶剂(水-乙腈＝80:20)溶解，定容，摇匀，作为供试品溶液，临用现制。直接按照实施5中所述的仪器与实验条件中进行分析，出口缓冲液瓶中含有hp-β-cd，见图4，图中标识出主要组分e1、e2，主要组分与相邻有关物质均实现了较好的分离，适合于定性定量分析。

对比例1

本对比例为采用文献(journalofchromatographya,879(2000)，211–218)中所述的方法对多黏菌素b进行分离及测定，其电泳图如图5所示。

根据实施例5与对比例1的电泳图对比可知，与已报道的毛细管电泳方法相比，本发明所述的毛细管电泳方法首次采用羟丙基-β-环糊精作为分离介质，特别适合于国产多黏菌素b的分析，其对组分b1及b1-i与相邻杂质的分离较好。

根据实施例6可知，本发明进一步拓展了相关文献中的方法限制，证明了进口缓冲液、出口缓冲液中均可存在羟丙基-β-环糊精，避免基线上升或下降而导致的对有关物质定量不准确，如图4对多黏菌素e的分析中，进、出口缓冲液瓶中均含羟丙基-β-环糊精，基线平稳。

且与液相分析方法相比，本发明所述的毛细管电泳方法柱效高、样品及试剂消耗量极少、成本低。尤其是在多黏菌素临床的少量样本分析(如血样)时，优势明显，仅需进样几十纳升，即可测定其中的多黏菌素组分；另外，中国药典2015年版中多黏菌素e只有通过微生物效价法测定其含量，而该方法无法有效反映复杂多肽混合物中的组分差异，而本发明所述的方法可以准确测定其中各组分的含量。

因此，本发明中的技术方法易于操作，可快速灵敏地检测多黏菌素b、e中的组分及有关物质，也可适合于其他多黏菌素类抗菌肽组分及有关物质的检测。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。