一种基于光微流激光的免疫比浊蛋白质分析仪的制作方法

本发明属于传感器技术领域，具体涉及一种基于光微流激光的免疫比浊蛋白质分析仪。

技术背景

免疫比浊法已广泛应用于生物医学、食品卫生、环境监测等诸多领域。传统的免疫比浊法主要是利用抗原抗体的特异性结合，在强电解质的作用下，形成粒径较大的复合物。在抗体过量的情况下，复合物的形成量与抗原的浓度成正比。光与复合物相互作用，会发生散射、吸收和反射，且透射光或散射光强度与待测抗原浓度成比例关系。该方法具有耗时短、免洗、均相反应等优点，但灵敏度较低、样品用量大等缺点限制了它的应用范围。

光微流技术是光学技术(传感，操控，成像)和微流系统的集成。将微流通道置于两片反射镜之间即可构成一个法珀腔。通道内的激光染料在泵浦光的作用下产生受激辐射。受激辐射光子在两面镜子之间来回反射，不断增强，最终形成激光输出。将待测样品形成的复合物与染料进行混合，复合物的浓度对激光腔内的激光产生不同程度的损耗，从而影响输出激光的强度。因此，这种检测方法具有很高的灵敏度。传统免疫蛋白分析仪多采用探测光一次穿透比色皿的方式进行检测，且样品和试剂用量大。与传统方法相比，本发明利用法珀腔光微流激光的高灵敏度特性，提出了一种新的免疫比浊蛋白质分析仪，利用微流激光在腔内多次反射，可以显著提高传统免疫比浊法的检测性能。同时，通过改变染料的浓度、溶剂或种类，便可以实现不同蛋白质浓度的测量。

技术实现要素：

本发明针对

背景技术：
中提到的缺陷设计并制作了一种基于光微流激光的免疫比浊蛋白质分析仪。该蛋白质分析仪具有结构简单、测量精度高等特点。

一种基于光微流激光的免疫比浊蛋白分析仪，包括泵浦光源模块1、样品检测模块2和信号收集处理模块3三个部分。

所述泵浦光源模块包括：光参量振荡器(1)、会聚透镜(5)、反射镜(6)，所述光参量振荡器(1)输出脉冲泵浦光，经会聚透镜(5)会聚，再经过反射镜(6)，与上反射镜(8)的法线方向成13-17度角入射到法珀谐振腔。

所述样品检测模块包括：微流通道(7)、上反射镜(8)、支撑结构(9)、下反射镜(10)，所述上反射镜(8)与下反射镜(10)平行设置构成法珀谐振腔，为微流激光提供光反馈，微流通道(7)和支撑结构(9)设置于法珀谐振腔内；所述脉冲泵浦光入射到法珀谐振腔内后，染料分子吸收脉冲泵浦光能量，从基态跃迁到激发态，当大量染料分子都处于激发态时，会发生粒子数反转，染料分子发生受激辐射，产生激光信号输出。

所述信号收集处理模块包括：收集元件(11)、光纤(12)、光谱仪(13)、计算机(14)，所述收集元件(11)将收集到的激光信号耦合到光纤(12)中，激光信号沿光纤(12)传输到光谱仪(13)，光谱仪(13)对激光信号进行处理，并将处理结果输出到计算机(14)。

进一步地，所述泵浦光源模块还包括小孔光阑(2)、可调衰减片(3)、能量探头(4)。所述光参量振荡器(1)输出的脉冲泵浦光经过小孔光阑(2)后通过可调衰减片(3)调节，并通过能量探头(4)，再经会聚透镜(5)会聚。所述小孔光阑(2)可对脉冲泵浦光进行空间滤波和光束整形。所述可调衰减片(3)可对脉冲泵浦光的能量进行调节。所述能量探头(4)可对脉冲泵浦光的能量进行实时监测。

进一步地，所述上、下反射镜的反射率均高于90％，可采用低成本的金属膜或者性能优异的介质膜，提高反射率，进一步提升探测灵敏度。

进一步地，光参量振荡器激光波长可调的范围是189-2500nm。可根据染料的类型选用不同波长的脉冲激光进行泵浦，常见的脉冲激光波长可选355nm，532nm，635nm，808nm，1064nm等。

进一步地，所述微流通道(7)由方形石英毛细管和软管构成，方形石英毛细管的外径为1.4mm×1.4mm，内径为1.1mm×1.1mm。方形石英毛细管和塑料软管之间采用紫外胶固化连接。微流通道可采用壁厚更薄，透过率更高的材料，进一步减小法珀谐振腔内的损耗，进而提高检测灵敏度。所述支撑结构(9)可采用与微流通道(7)同尺寸的方形毛细管、金属块等，以增强法珀谐振腔的稳定性。

本发明将光微流激光技术与免疫比浊法结合。一方面，抗原抗体在特定条件下会发生特异性结合，并在强电解质作用下形成粒径较大的复合物。当抗体过量时，形成的复合物浓度与抗原浓度成正比。另一方面，光微流激光技术一般采用脉冲泵浦光源作为泵浦光源，将染料作为增益介质通入到谐振腔内可实现激光输出，通过改变泵浦光的波长，染料的种类和法珀谐振腔的尺寸可实现不同波长的激光信号输出。将抗原抗体形成的复合物和染料混匀，一起通入到法珀谐振腔内，产生的微流激光会在腔内多次反射，增强光与复合物相互作用。当复合物粒径远小于微流激光波长时，会产生瑞利散射，微流激光强度会发生显著降低。而且微流激光的强度下降的程度与复合物的浓度成正比，因此可以通过探测微流激光的强度来实现待测蛋白质浓度的传感。

本发明的有益效果为：

1、本发明利用光微流激光在法珀谐振腔内多次反射，增加了激光与复合物之间的作用次数，可以提高蛋白质检测的灵敏度。

2、本发明提供的免疫球蛋白g浓度测量方法灵敏度高，操作简单，所需检测样品量少，可对各种免疫球蛋白含量进行测定。

3、本发明提供的免疫球蛋白g浓度测量方法可改变染料的种类和脉冲泵浦光的波长，从而实现不同波长的激光输出，根据待测蛋白质形成的复合物的粒径大小选择不同的染料和脉冲泵浦光，从而实现不同种类的蛋白质浓度的分析。

附图说明

图1为本发明提供的光微流激光免疫比浊蛋白质分析仪的结构示意图

图2为本发明提供的光微流激光免疫比浊蛋白质分析仪的截面图

图3为抗原抗体反应原理图

图4为本发明提供的光微流激光免疫比浊蛋白质分析仪的激光强度和蛋白质浓度的关系曲线

具体实施方法

一种基于光微流激光的免疫比浊蛋白质分析仪的制作及使用方法，具体包括以下步骤：

本实施例的光微流激光的免疫比浊蛋白质分析仪包括泵浦光源模块1、样品检测模块2和信号收集处理模块3三个部分。所述泵浦光源模块包括：532nm脉冲激光器(1)、会聚透镜(5)、反射镜(6)，所述532nm脉冲激光器(1)输出脉冲泵浦光，利用小孔光阑(2)对脉冲泵浦光进行空间滤波和光束整形，通过可调衰减片(3)对脉冲泵浦光能量进行调节，并由能量探头(4)进行实时监测，然后经会聚透镜(5)会聚，再经过反射镜(6)，与上反射镜(8)的法线方向成15度角入射到法珀谐振腔；同时，将收集元件(11)位置调好并固定，然后用光纤(12)将其与光谱仪(13)连接，使得光谱仪的输出信号传输至计算机(14)。

所述样品检测模块包括：反射率为91.5％的上反射镜(8)，反射率为99.5％的下反射镜(10)，反射膜材质均为介质膜。微流通道(7)包括方形石英毛细管以及两侧连通的圆形塑料软管，将方形毛细管两端与圆形塑料软管相连，连接处使用紫外胶进行固化填充。将微流通道(7)与支撑结构(9)一起放入到两反射镜之间，构成法珀谐振腔。同时调节法珀谐振腔的位置，使得会聚光束恰好入射到法珀谐振腔内。

将标准品按照一定的浓度梯度进行稀释，取10μl的稀释样品与1125μl的r1试剂(伊利康公司，免疫球蛋白g检测试剂盒)混合均匀，置于37℃的水浴锅中，恒温加热孵育5min。再向上述混合溶液中加入375μl的r2试剂(伊利康公司，免疫球蛋白g检测试剂盒)并混合均匀，置于37℃的水浴锅中，恒温加热孵育5min。取900μl反应完成的溶液于另一个离心管中，向其中加入100μl浓度为1.2mm的罗丹明b水溶液，混合均匀。

将混合好的溶液通入微流通道(7)中，如图2所示。打开脉冲泵浦光源，记录下不同浓度的标准品所对应的激光强度。每次测量时，观察能量探头(4)示数，同时调节可调衰减片(3)，以确保每次泵浦能量一致。再将不同浓度的标准品与对应的激光强度绘制出一条标准曲线。

对于待测样品，重复上述测量步骤，将测得的激光强度与标准曲线进行比对，即可得到样品的具体浓度。

如图3所示，抗原抗体发生特异性结合，并在强电解质的作用下，经过一段时间之后，在强电解质的作用下形成粒径较大的复合物。将微流通道(7)置于两反射镜之间即可构成一个法珀腔。通道内的激光染料在泵浦光的作用下产生受激辐射。受激辐射光子在两面镜子之间来回反射，不断增强，最终形成激光信号输出。将待测样品形成的复合物与染料进行混合，复合物浓度对激光腔内的激光产生不同程度的损耗，从而影响输出激光信号的强度。当泵浦能量固定在35.37uj/mm²时，实验标定的标准品浓度与激光强度的关系曲线如图4所示。

对于不同的待测蛋白可选用对应的染料和泵浦波长。例如西门子公司生产的igm试剂盒，其形成的复合物粒径在800nm左右，因此可以将染料换成hitc，泵浦波长选用600nm。因此，在此装置上也可以完成igm浓度的检测。