一种嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸的分析方法与流程

本发明涉及分析化学检测技术领域，更具体的说，涉及一种高效液相色谱法(hplc)定量分析嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸的方法。

背景技术：

嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)属乳杆菌科中的乳杆菌属，为革兰氏阳性菌，形态为细长杆状，以单个、成对或短链形式存在，无芽孢，无鞭毛。嗜酸乳杆菌是乳酸菌家族中极为重视研究与开发的益生菌之一，被视为第三代酸奶发酵剂菌种，还是人体肠道中的重要微生物，与人体健康息息相关，当其达到一定数量时，可以起到促进健康的效果。嗜酸乳杆菌对食物中滋生的肠道病原菌有拮抗作用，可以稳定正常的肠道微生物区系，能降低血清胆固醇，具有抗癌、益生作用。最新研究发现，补充益生菌除了能够直接改变肠道菌群的构成和功能，还能够改善抑郁症和焦虑等症状，因此也被称为精神型微生物。

研究发现，嗜酸乳杆菌代谢产物中含有多种有机酸，有机酸能有效抑制革兰氏阴性致病菌的活性，以未解离状态进入致病菌细胞，在细胞质内解离，从而降低胞内ph或胞内有机酸的离子积累，导致致病菌死亡，而有机酸中主要发挥抑制作用的是乳酸和乙酸。已有研究报道，有机酸中以乳酸为主，乙酸仅为乳酸的1/5-1/10，最佳为1/8-1/10，测定乳酸和乙酸含量及比例，可以间接地了解细菌的生长状况，对于改进培养条件具有重要的参考价值。目前，有机酸的检测方法主要有气相色谱法、离子色谱法和液相色谱法。气相色谱法不仅需要液-液萃取将有机酸萃取到有机相，还需进行衍生化，以提高检测的灵敏度，操作繁琐。离子色谱法虽然对于样品预处理的要求比较简单，但高浓度的无机离子可能会干扰有机酸根离子的测定。相比之下，高效液相色谱法操作简单，准确度较高，应用较多。因此，本发明选用高效液相色谱法(hplc)定量分析测定嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸，可为了解细菌的生长状况和优化培养条件提供参考，并能够通过检测培养基中有机酸的种类和相互比例用于细菌的分类鉴定。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种高效液相色谱法(hplc)定量分析嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸的方法。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：一种高效液相色谱法(hplc)定量分析嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸的方法，该方法包括如下步骤：

s1、mrs粉末溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15-20min，制成mrs液体培养基；

s2、将复苏活化后的嗜酸乳杆菌在od600＝0.9的条件下，以3％体积比接种到100ml上述mrs液体培养基中，37℃静置培养30h；

s3、将培养液以8000r/min的转速高速离心5min，获取上清液，用0.22μm孔径过滤器过滤2次，然后将上清液稀释10倍，存于样品瓶中，4℃保存备用；

s5、比较0.01mol/l的nah2po4和kh2po4两种溶液作为流动相时，乳酸和乙酸的分离情况；

s6、比较流动相溶液浓度分别为0.01mol/l,0.02mol/l,0.03mol/l时，对乳酸和乙酸的出峰顺序和分离效果的影响；

s6、色谱条件为：流动相为0.01mol/l磷酸二氢钠缓冲溶液，流速1ml/min，柱温30℃，用c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)分离，检测波长为215nm，检测时间10min，进样量10μl。

其中，乳酸和乙酸的线性范围为1.0-50.0mmol/l；乳酸的加标回收率为97.5％-103.0％，相对标准偏差为1.39％；乙酸的加标回收率为96.5％-103.8％，相对标准偏差为3.56％。

本发明具有如下优点：

1、本发明采用高效液相色谱法定量分析，方法线性关系良好，且准确度和精密度较高，具有较好的重复性，适用于嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸的定量分析。

2、本发明可为了解细菌的生长状况和优化培养条件提供参考，并能够通过检测培养基中有机酸的种类和相互比例用于细菌的分类鉴定。

附图说明

图1为实施例1的不同培养时间的乳酸和乙酸浓度的变化图。

图2为实施例2的不同流动相条件下的代谢产物色谱图。

图3为实施例3的有机酸标样和代谢产物样品的色谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细说明，但并不因此而限制于本发明。

实施例1

mrs粉末溶于蒸馏水中，121℃高压灭菌15-20min，制成8份mrs液体培养基；将复苏活化后的嗜酸乳杆菌在od600＝0.9的条件下，以3％体积比接种到100ml上述mrs液体培养基中，37℃分别静置培养18、20、22、24、26、28、30、32h时获取嗜酸乳杆菌代谢产物，并对其乳酸和乙酸进行分析；将培养液以8000r/min的转速高速离心5min，获取上清液，用0.22μm孔径过滤器过滤2次，然后将上清液稀释10倍，得到待分析的样品，然后将样品存于样品瓶中，4℃保存备用。

实施例2

比较0.01mol/l的nah2po4和kh2po4两种溶液作为流动相时，乳酸和乙酸的分离情况；然后比较流动相溶液浓度为0.01mol/l,0.02mol/l,0.03mol/l时，对乳酸和乙酸的出峰顺序和分离效果的影响。

对于实施例1、2中的实验结果进行如乳酸浓度测试及高效液相色谱法分析。

图1显示当培养时间达到30h时，乳酸和乙酸的代谢产物达到最大值，在此期间，细菌数目和活性趋于稳定，培养液中营养物质大量消耗而代谢产物中乳酸和乙酸的产量达到最大。图2展示了这两种无机磷酸盐对乳酸和乙酸的出峰顺序和分离效果无显著性差异，但是nah2po4缓冲液作为流动相时，乳酸和乙酸的分析时间相对较短，所以选择nah2po4溶液作为流动相，而且三种浓度下，有机酸均能得到有效分离，而且停留时间也无显著差异，考虑到高盐浓度对泵和色谱柱的不利影响，选用0.01mol/lnah2po4溶液作为流动相。

本发明提供的高效液相色谱法(hplc)定量分析嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸的方法，优化后的色谱条件为：流动相为0.01mol/l磷酸二氢钠缓冲溶液，流速1ml/min，柱温30℃，用c18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)分离，检测波长为215nm，检测时间10min，进样量10μl。整个过程可在10min内完成，图3为采用优化后的分析条件获得的样品和有机酸标样的hplc分析图谱。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：

技术总结
本发明提供了一种嗜酸乳杆菌代谢产物中乳酸和乙酸的分析方法，采用高效液相色谱法定量测定。色谱条件为：流动相为0.01mol/L磷酸二氢钠缓冲溶液，流速1mL/min，柱温30℃，用C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)分离，检测波长为215nm，检测时间10min，进样量10μL。在优化的色谱条件下，乳酸和乙酸的线性范围为1.0‑50.0mmol/L，乳酸和乙酸的加标回收率分别为97.5％‑103％，96.5％‑103.8％，相对标准偏差分别为1.39％和3.56％。本方法灵敏快速，为了解细菌的生长状况和优化培养条件提供参考，并能够通过检测培养基中有机酸的种类和相互比例用于细菌的分类鉴定。

技术研发人员：关水;孙长凯;许建强;魏佳旭;刘璐
受保护的技术使用者：大连理工大学
技术研发日：2018.12.27
技术公布日：2019.05.21