癌症生酮饮食治疗中的生物标记物的开发的制作方法

本发明涉及癌症生酮饮食治疗中的生物标记物的开发。具体而言，涉及生酮饮食疗法会有效的癌症患者的选择方法、以及癌症患者的生酮饮食疗法的有效性的预测方法。

背景技术：

作为饮食疗法的一种，已知有“生酮饮食”。“生酮饮食”是限制碳水化合物的高脂肪食物，摄取能量的60～90％以脂肪摄取。因此，“生酮饮食”作为用于治疗需要限制碳水化合物的饮食的患者例如癫痫的儿童的饮食加以利用(例如专利文献1)。

近年来，提出了使用该“生酮饮食”的饮食疗法可以作为癌症患者的治疗方法(例如专利文献2)。已发现通过生酮饮食疗法显示出戏剧性的临床效果的病例。然而，并非对于全部癌症患者确认到了生酮饮食疗法的有效性，癌症患者的生酮饮食的效果的作用机理的细节仍是未知的。作为弄清其作用机理的一环，需要探索治疗标记物、反应性预测标记物。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特许第5937771号公报

专利文献2：国际公开第2017/038101号

技术实现要素：

发明要解决的问题

生酮饮食由于为高脂肪，因此会对摄取生酮饮食的癌症患者产生较大负担。为了减轻癌症患者的负担，需要以高准确率选择生酮饮食有效的癌症患者。即使在实施了生酮饮食疗法的情况下，如果能够在完成前预测生酮饮食疗法的效果是否会表现，则也有助于减轻患者的负担。

因此，本发明的目的在于提供在实施生酮饮食疗法前可以简便地选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者的选择方法。此外，本发明的目的在于提供在完成癌症患者的生酮饮食疗法前预测生酮饮食疗法的有效性的预测方法。

用于解决问题的方案

本发明的生酮饮食疗法会有效的癌症患者的选择方法的特征在于，对于来源于摄取生酮饮食前的癌症患者的血清，得到选自由酰基肉碱(12：0)、酰基肉碱(12：1)-2、酰基肉碱(12：1)-3、酰基肉碱(14：1)-1、酰基肉碱(14：2)-1、酰基肉碱(14：2)-2、酰基肉碱(14：3)-2、酰基肉碱(16：1)、酰基肉碱(16：2)、花生四烯酰乙醇胺、十七碳烯酸、亚牛磺酸、亚油酰乙醇酰胺、棕榈油酸、棕榈酰肉碱、植物鞘氨醇、奎尼酸、尿酸、丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和赖氨酸组成的组中的至少1种摄取前候选物质的分析结果，以前述分析结果作为指标。

本发明的癌症患者的生酮饮食疗法的有效性的预测方法的特征在于，对于来源于摄取了生酮饮食的癌症患者的血清，得到选自由二乙醇胺、组氨酸、羟脯氨酸、硬脂酰乙醇酰胺、豆甾醇、胱氨酸和酪氨酸组成的组中的至少1种摄取后候选物质的分析结果，以前述分析结果作为指标。

发明的效果

根据本发明的选择方法，对于来源于摄取生酮饮食前的癌症患者的血清，得到摄取前候选物质中的至少1种的分析结果。通过以所得分析结果作为指标，能够在摄取生酮饮食前选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者。

此外，根据本发明的预测方法，对于来源于摄取了生酮饮食的癌症患者的血清，得到摄取后候选物质中的至少1种的分析结果。通过以所得分析结果作为指标，能够在完成生酮饮食疗法前预测癌症患者的生酮饮食疗法的有效性。

附图说明

图1是使用代谢组学分析的结果实施的偏最小二乘法(pls：partialleastsquares)分析的结果。

具体实施方式

以下，对本发明的实施方式进行详细说明。

在本发明中，生酮饮食是指生酮比(脂质：(蛋白质+碳水化合物))按重量比计为2：1～1：1左右的饮食。生酮饮食疗法是指将这样的生酮饮食摄取规定时间(例如3个月)即可，对其他营养素没有特别限制。生酮饮食疗法中，所需的微量元素、维生素可以使用营养补充剂等来适当摄取。

在本说明书中使用的“癌症”例如包括正常细胞发生突变而产生的肿瘤。恶性肿瘤有可能从全身的所有器官、组织产生。作为本说明书中的癌症患者，例如可列举出患肺癌、卵巢癌、膀胱癌、口唇腺样囊性癌、肾癌、尿路上皮癌、大肠癌、前列腺癌、多形性胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、胃癌和食道癌等癌症的患者。只要可以摄取生酮饮食，则性别和年龄没有特别限制，任意的癌症患者均为本发明的对象。

在本发明的选择方法中，使用取自摄取生酮饮食前的癌症患者的血清作为检测材料。以检测材料中的物质中预先确定的摄取前候选物质中的至少1种的分析结果作为指标，选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者。摄取前候选物质为酰基肉碱(12：0)、酰基肉碱(12：1)-2、酰基肉碱(12：1)-3、酰基肉碱(14：1)-1、酰基肉碱(14：2)-1、酰基肉碱(14：2)-2、酰基肉碱(14：3)-2、酰基肉碱(16：1)、酰基肉碱(16：2)、花生四烯酰乙醇胺、十七碳烯酸、亚牛磺酸、亚油酰乙醇酰胺、棕榈油酸、棕榈酰肉碱、植物鞘氨醇、奎尼酸、尿酸、丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和赖氨酸。

检测材料例如可以通过后述的代谢组学分析进行分析。检测材料中的摄取前候选物质例如优选通过使用高效液相色谱(hplc)的氨基酸测定等分别进行分析。以至少1种摄取前候选物质的分析结果作为指标，能够选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者。摄取前候选物质的数量越多，越能够以高精度选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者。

在本发明的预测方法中，使用取自摄取了生酮饮食的癌症患者的血清作为检测材料。“摄取了生酮饮食的癌症患者”是指完成生酮饮食疗法前的正在实施生酮饮食疗法的癌症患者。以检测材料中的物质中预先确定的摄取后候选物质中的至少1种的分析结果作为指标，预测生酮饮食疗法的有效性。摄取后候选物质为二乙醇胺、组氨酸、羟脯氨酸、硬脂酰乙醇酰胺、豆甾醇、胱氨酸和酪氨酸。

检测材料中的摄取后候选物质如上所述，优选通过使用hplc的氨基酸测定等进行分析得到分析结果。通过以至少1种摄取后候选物质的分析结果作为指标，能够预测生酮饮食疗法的有效性。摄取后候选物质的数量越多，越能够以高精度预测癌症患者的生酮饮食疗法的有效性。

摄取前候选物质和摄取后候选物质可以根据对受试患者组实施生酮饮食疗法的结果来确定。受试患者是指罹患了上述癌症的患者。受试患者只要可以摄取生酮饮食，则性别和年龄没有特别限制。

摄取前候选物质可以通过以下说明的方法来确定。首先，对来源于摄取生酮饮食前的受试患者组的血清通过代谢组学分析进行分析，得到血清中的多种物质的分析结果。代谢组学分析例如可以使用毛细管电泳-飞行时间型质谱仪(ce-tof/ms)和液相色谱-飞行时间型质谱仪(lc-tof/ms)。

对于针对各物质检测得到的峰，进行基于代谢物库的注释并实施统计分析，可得到分析结果。一般，通过代谢组学分析，能够分析血清中的200种左右的物质。针对来源于各个受试患者的血清中的各物质的分析结果记录为“生酮饮食摄取前的分析结果”。

使受试患者组摄取规定的生酮饮食，实施生酮饮食疗法。3个月后，对于可进行临床评价的受试患者，评价治疗效果。需要说明的是，可进行“临床评价的受试患者”是指“至少摄取了3个月的生酮饮食的受试患者”。治疗效果基于ct图像中的肿瘤的大小如下进行判定。

完全缓解(cr)肿瘤完全消失

恶化(pd)肿瘤的大小之和增加20％以上且绝对值也增加5mm以上、或者出现新病变

维持(sd)肿瘤的大小无变化

将被判定为完全缓解的受试患者记为缓解组(以下也称为cr组)，将被判定为恶化的受试患者和被判定为维持的受试患者合并记为恶化维持组(以下也称为pd/sd组)。将所记录的“生酮饮食摄取前的分析结果”分为cr组的结果和pd/sd组的结果。

针对每个物质比较cr组的结果和pd/sd组的结果，通过韦尔奇的t检验(welch’st-test)判定两者之间的显著性差异。抽出确认到显著性差异的物质作为摄取前候选物质。

摄取后候选物质可以通过以下说明的方法来确定。对于摄取规定的生酮饮食3个月后的受试患者组中可进行临床评价的受试患者，与上述同样地评价治疗效果。基于治疗效果的评价结果，如上所述地从受试患者中选择cr组和pd/sd组。

对来源于cr组和pd/sd组的血清进行代谢组学分析(metabolomicanalysis)，得到血清中的多种物质的分析结果。针对血清中的各物质的分析结果形成“生酮饮食摄取后的分析结果”。在cr组与pd/sd组之间针对每个物质比较“生酮饮食摄取后的分析结果”，与上述同样地判定两者之间的显著性差异。

从多种物质中抽出在cr组与pd/sd组之间确认到显著性差异的物质作为摄取后候选物质。

<作用和效果>

本实施方式的选择方法采用血清中的规定的物质作为摄取前候选物质。通过对于来源于摄取生酮饮食前的癌症患者的血清，以摄取前候选物质中的至少1种的分析结果作为指标，能够在摄取生酮饮食前选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者。

本实施方式的预测方法采用与摄取前候选物质不同的规定的物质作为摄取后候选物质。通过对于来源于摄取了生酮饮食的癌症患者的血清，以摄取后候选物质中的至少1种的分析结果作为指标，能够预测癌症患者的生酮饮食疗法的有效性。

<实施例>

以下，通过实施例对本发明进行具体说明，但本发明并不受这些实施例的限定。

受试患者组的人数为5名(女性2名、男性3名)。关于患者背景，关于女性，均为肺癌，1例为56岁、159cm、49.8kg，另1例为53岁、151cm、44.3kg，关于男性，为肺癌1例、膀胱癌1例、口唇腺样囊性癌1例、60.6±13.0岁、174.1±0.23cm、61.5±5.8kg、bmi20.3±1.9。

对于取自摄取生酮饮食前的受试患者组的血清5份检测材料，如上所述通过使用ce-tof/ms和lc-tof/ms的代谢组学分析进行分析，对血清中的多种物质进行统计分析。关于所使用的分析仪，ce-tof/ms使用agilientce-tofms系统(agilienttechnologies公司制造)、毛细管:熔融石英毛细管i.d.50μm×80cm，并且lc-tof/ms使用lc系统:agilient1200seriesrplcsystemsl(agilienttechnologies公司制造)、柱:ods柱2×50mm,2μm,ms系统:agilientlc/msdtof(agilienttechnologies公司制造)。

用ce-tof/ms的分析中，共检测到173个峰(其中，阳离子模式下108个、阴离子模式下65个)。lc-tof/ms的分析中，共检测到169个峰(其中，正向模式下80个、负向模式下89个)。针对各物质的分析结果对于各受试患者记录为“生酮饮食摄取前的分析结果”。

在生酮饮食摄取前所分析的物质中包括酰基肉碱(12：0)、酰基肉碱(12：1)-2、酰基肉碱(12：1)-3、酰基肉碱(14：1)-1、酰基肉碱(14：2)-1、酰基肉碱(14：2)-2、酰基肉碱(14：3)-2、酰基肉碱(16：1)、酰基肉碱(16：2)、花生四烯酰乙醇胺、十七碳烯酸、亚牛磺酸、亚油酰乙醇酰胺、棕榈油酸、棕榈酰肉碱、植物鞘氨醇、奎尼酸和尿酸等。

对于受试患者组，进行如下所述的生酮饮食疗法。本临床研究获得大阪大学基因组审查委员会的认可而实施。

(1)最初的1周，卡路里基于实际体重设为30kcal/kg，无脂质限制，无蛋白质限制，以碳水化合物10g以下为目标。具体而言，例如假设实际体重为50kg，设为每日卡路里1500kcal、脂质140g、蛋白质60g、碳水化合物10g。

生酮饮食中的生酮比(脂质：(蛋白质+碳水化合物))以2：1为目标。其他营养素可无限制地摄取，所需的微量元素、维生素使用营养补充剂等来适当摄取。

(2)第2周～3个月期间，参考血中酮体的值来设定饮食内容。血中酮体测定乙酰乙酸、β-羟基丁酸的浓度。碳水化合物的1日摄取量设为20g以下，设为每日卡路里1400～1600kcal、脂质120～140g、蛋白质70g、碳水化合物20g，生酮比以2：1～1：1为目标。在补充卡路里时，使用“mctoil”(thenisshinoilliogroup,ltd.制造)或“ketoneformula”(株式会社明治制造)。

在实施生酮饮食疗法时，对于受试患者组，说明可能会出现暂时性的低血糖、恶心、疲劳感等，实际的营养学上的指导在营养师的指导下进行。

对于来源于摄取生酮饮食3个月后的受试患者组的血清5份检测材料，与上述同样地通过代谢组学分析进行分析，针对血清中的多种物质进行统计分析。针对各物质的分析结果对于各受试患者记录为“生酮饮食摄取后的分析结果”。

在摄取生酮饮食后所分析的物质中包括二乙醇胺、组氨酸、羟脯氨酸、硬脂酰乙醇酰胺和豆甾醇等。

进而，对于摄取生酮饮食3个月后的受试患者组，评价生酮饮食疗法的治疗效果。治疗效果基于上述标准分类为完全缓解(cr)、恶化(pd)和维持(sd)。

缓解组(cr组)和恶化维持组(pd/sd组)如下。

cr组：2例(女性2名，均为肺癌，1例为56岁、159cm、49.8kg，另1例为53岁、151cm、44.3kg)

pd/sd组：3例(男性3名，肺癌1例、膀胱癌1例、口唇腺样囊性癌1例、50.6±13.0岁、174.1±0.23cm、61.5±5.8kg、bmi20.3±1.9)

将所记录的“生酮饮食摄取前的分析结果”分为cr组(2份检测材料)和pd/sd组(3份检测材料)，针对每种物质算出峰面积的平均值和标准偏差。进而，针对各物质求出峰面积比(cr/(pd/sd))，并且根据p值判定显著性差异。显著性差异判定以韦尔奇的t检验实施。将在cr组与pd/sd组之间确认到显著性差异的物质和算出结果一起汇总于下述表1。

“生酮饮食摄取后的分析结果”也同样，分为cr组(2份检测材料)和pd/sd组(3份检测材料)，针对每种物质算出峰面积的平均值和标准偏差。进而，针对各物质求出峰面积比(cr/(pd/sd))，并且根据p值判定显著性差异。将在与cr组与pd/sd组之间确认到显著性差异的物质和算出结果一起汇总于下述表2。

[表1]

[表2]

表2

上述表1和表2示出在cr组与pd/sd组之间在血清中的物质的分析结果上存在差异。根据上述表1，在cr组与pd/sd组之间在生酮饮食摄取前确认到显著性差异的物质为酰基肉碱(12：0)、酰基肉碱(12：1)-2、酰基肉碱(12：1)-3、酰基肉碱(14：1)-1、酰基肉碱(14：2)-1、酰基肉碱(14：2)-2、酰基肉碱(14：3)-2、酰基肉碱(16：1)、酰基肉碱(16：2)、花生四烯酰乙醇胺、十七碳烯酸、亚牛磺酸、亚油酰乙醇酰胺、棕榈油酸、棕榈酰肉碱、植物鞘氨醇、奎尼酸和尿酸。

生酮饮食摄取前的血清中的酰基肉碱(12：0)、酰基肉碱(12：1)-2、酰基肉碱(12：1)-3、酰基肉碱(14：1)-1、酰基肉碱(14：2)-1、酰基肉碱(14：2)-2、酰基肉碱(14：3)-2、酰基肉碱(16：1)、酰基肉碱(16：2)、花生四烯酰乙醇胺、十七碳烯酸、亚牛磺酸、亚油酰乙醇酰胺、棕榈油酸、棕榈酰肉碱、植物鞘氨醇、奎尼酸和尿酸构成判断是否为生酮饮食疗法会有效的患者的指标。即，这18种物质为摄取前候选物质。

因此，对来源于生酮饮食摄取前的癌症患者的血清进行分析，以酰基肉碱(12：0)、酰基肉碱(12：1)-2、酰基肉碱(12：1)-3、酰基肉碱(14：1)-1、酰基肉碱(14：2)-1、酰基肉碱(14：2)-2、酰基肉碱(14：3)-2、酰基肉碱(16：1)、酰基肉碱(16：2)、花生四烯酰乙醇胺、十七碳烯酸、亚牛磺酸、亚油酰乙醇酰胺、棕榈油酸、棕榈酰肉碱、植物鞘氨醇、奎尼酸和尿酸中的至少1种的分析结果作为指标，能够选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者。

此外，根据上述表2，在cr组与pd/sd组之间在3个月的生酮饮食摄取后确认到显著性差异的物质为二乙醇胺、组氨酸、羟脯氨酸、硬脂酰乙醇酰胺和豆甾醇。

生酮饮食摄取后的血清中的二乙醇胺、组氨酸、羟脯氨酸、硬脂酰乙醇酰胺和豆甾醇构成生酮饮食疗法是否有效发挥作用的指标。即，这5种物质为摄取后候选物质。

因此，对来源于摄取了生酮饮食的癌症患者的血清进行分析，以二乙醇胺、组氨酸、羟脯氨酸、硬脂酰乙醇酰胺和豆甾醇中的至少1种的分析结果作为指标，能够预测癌症患者的生酮饮食疗法的有效性。

需要说明的是，cr组有2例、pd/sd组有1例是实施了12个月的生酮饮食疗法的受试患者，由这些患者得到的血清也与上述同样地实施代谢组学分析，与上述开始前和3个月的数据一起进行主要成分分析和提供了组信息的pls分析。图1示出其结果。

图1中，黑色圆圈标记(cr0-1、cr0-2)表示cr组的开始前的检测材料，黑色三角标记(cr3-1、cr3-2)表示cr组的3个月后的检测材料，黑色菱形标记(cr12-1、cr12-2)表示cr组的12个月后的检测材料，白色圆圈标记(pd/sd0-1、pd/sd0-2、pd/sd0-3)表示pd/sd组的开始前的检测材料，白色三角标记(pd/sd3-1、pd/sd3-2)表示pd/sd组的3个月后的检测材料，白色菱形标记(pd/sd12-1)表示pd/sd组的12个月后的检测材料。

由cr组与pd/sd组的检测材料的结果沿pls1轴方向分离可发现在pls1轴与检测材料的组之间存在相关性。通过研究与pls1轴对应的因子载荷量，能够提取相关性高的物质。与pls1轴相关性高的物质为奎尼酸、咖啡因、副黄嘌呤、葫芦巴碱、可可碱、n-乙酰基鞘氨醇、花生四烯酰乙醇胺。因此，关于奎尼酸、咖啡因、副黄嘌呤、葫芦巴碱、可可碱、n-乙酰基鞘氨醇、花生四烯酰乙醇胺，也暗示了其构成评价生酮饮食疗法的某种生物标记物的可能性。

<基于其他分析方法的验证例>

对于取自生酮饮食摄取前后的癌症患者的血清，通过使用hplc的氨基酸测定进行分析，使用所得峰面积实施统计分析。

癌症患者的人数为13名(女性9名、男性4名)。患者背景为肺腺癌1例、卵巢癌1例、非小细胞肺癌1例、乳癌2例、左唇腺样囊性癌、盲肠癌腹膜扩散、乳癌直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、直肠乙状结肠癌、左咽旁间隙恶性肿瘤、转移性肺肿瘤各1例。

对于取自摄取生酮饮食前的癌症患者的13份血清检测材料，通过使用hplc的氨基酸测定进行分析，对血清中的多种物质进行统计分析。所使用的分析仪为l-8800型高速氨基酸分析仪(株式会社日立制作所制造)。针对各物质的分析结果对于各癌症患者记录为“生酮饮食摄取前的分析结果”。

在获得大阪大学基因组审查委员会的承认而实施的临床研究中，将取得同意的病例中的、完成3个月的生酮饮食疗法且可进行临床评价的病例作为对象。生酮饮食疗法的内容如上所述。

对于取自摄取生酮饮食3个月后的癌症患者的13份血清检测材料，与上述同样地通过使用hplc的氨基酸测定进行分析，对血清中的多种物质进行统计分析。针对各物质的分析结果对于各癌症患者记录为“生酮饮食摄取后的分析结果”。

生酮饮食摄取后，缓解组(cr组)和恶化维持组(pd/sd组)如下。

cr组：3例(女性3名、肺腺癌1例、卵巢癌1例、非小细胞肺癌1例、55.0±1.7岁、155±4.0cm、46.5±2.9kg)

pd/sd组：10例(女性6名、男性4名、乳癌2例、左唇腺样囊性癌、盲肠癌腹膜扩散、乳癌直肠癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、直肠乙状结肠癌、左咽旁间隙恶性肿瘤、转移性肺肿瘤各1例、58.5±15.5岁、162.1±7.7cm、54.4±9.5kg)

将所记录的“生酮饮食摄取前的分析结果”分为cr组(3份检测材料)和pd/sd组(10份检测材料)，针对每种物质算出峰面积的平均值和标准偏差。进而，针对各物质求出峰面积比(cr/(pd/sd))，并且根据p值判定显著性差异。显著性差异判定以韦尔奇的t检验实施。将在cr组与pd/sd组之间确认到显著性差异的物质和算出结果一起汇总于下述表3。

“生酮饮食摄取后的分析结果”也同样，分为cr组(3检测材料)和pd/sd组(10检测材料)，针对每种物质算出峰面积的平均值和标准偏差。进而，针对各物质求出峰面积比(cr/(pd/sd))，并且根据p值判定显著性差异。将在cr组与pd/sd组之间确认到显著性差异的物质和算出结果一起汇总于下述表4。

[表3]

表3

[表4]

表4

根据上述表3，在cr组与pd/sd组之间在生酮饮食摄取前在峰面积值上确认到显著性差异的物质为丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和赖氨酸。生酮饮食摄取前的血清中的丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和赖氨酸构成是否为生酮饮食疗法会有效的患者的指标。这4种物质与前述的18种物质同样为摄取前候选物质。

对来源于生酮饮食摄取前的癌症患者的血清进行分析，在以丙氨酸、瓜氨酸、色氨酸和赖氨酸中的至少1种的分析结果作为指标的情况下，也能够选择生酮饮食疗法会有效的癌症患者。

此外，根据上述表4，在cr组与pd/sd组之间在3个月的生酮饮食摄取后在峰面积值上确认到显著性差异的物质为胱氨酸、酪氨酸和组氨酸。生酮饮食摄取后的血清中的胱氨酸、酪氨酸和组氨酸构成生酮饮食疗法是否有效发挥作用的指标。对组氨酸已进行了说明，剩下2种物质也同样为摄取后候选物质。

对来源于摄取了生酮饮食的癌症患者的血清进行分析，在以胱氨酸和酪氨酸中的至少1种的分析结果作为指标的情况下，也能够预测癌症患者的生酮饮食疗法的有效性。