一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中TSNAs的方法与流程

本发明属于烟草制品化学分析技术领域，特别涉及一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中tsnas的方法。

背景技术：

烟草特有亚硝胺(tsnas)是卷烟烟气中一类重要的有害成分，目前已报道的tsnas有8种，其中n-亚硝基降烟碱(nnn)、4-(甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(nnk)、n-亚硝基新烟草碱(nat)和n-亚硝基假木贼碱(nab)4种研究较为深入。前人的研究表明：nnn、nnk具有1级致癌活性，nab、nat具有3级致癌活性，因此准确测定吸烟者尿液中的tsnas对于进一步深入了解吸烟与健康具有重要意义。

目前测定tsnas的方法主要有气相色谱-热能检测法(gc-tea)和液相色谱-三重四级杆质谱联用法(lc-ms/ms)，其中lc-ms/ms法灵敏度相对较高，非常适合用于吸烟者体内tsnas的代谢分析。但吸烟者尿液中的tsnas含量极低，即使是采用lc-ms/ms法也仍需要对样品进行高倍数的富集和干扰物分离后才能测定。目前，tsnas分析的样品前处理常采用固相萃取或柱层析进行分离净化，该类方法净化样品需多次的浓缩、转移，操作繁琐；而且还会因在敞开环境中大量使用有机溶剂而污染环境，对实验操作人员的健康危害大。因此，开发更为简单、快捷的样品前处理方法非常重要和迫切。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中tsnas的方法，其能够对吸烟者尿液中tsnas进行快速有效提取分离，无需多次的提取、转移、浓缩等过程，整个样品前处理过程高效简便，保障了检测结果的准确性和精密度。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为体积百分数。

一种利用带固相萃取功能的索氏提取装置检测吸烟者尿液中tsnas的方法，包括以下步骤：

(1)标准溶液的配制：分别称取0.1g的nnn，nnk，nat，nab于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml混合标准储备液，-20℃密封避光贮存；分别称取100mg的d⁴-nnn，d⁴-nnk，d⁴-nat，d⁴-nab于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml混合内标储备液，-20℃密封避光贮存；逐级稀释混合标准储备液得到6级标准工作溶液，对应各级浓度为：0.1ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml，然后加入混合内标储备液，使得各级标准工作液中的内标物浓度均为1.0ng/ml；样品萃取溶液为含1.0ng/ml内标的甲醇溶液，绘制标准工作曲线；

(2)样品前处理：准确量取吸烟者尿液样品80～120ml，浓缩至干；然后在尿液样品中加入4.0～6.0g的碱性氧化铝并使其与尿液充分研磨均匀，烘干；

(3)样品提取、浓缩：将步骤(2)处理好的样品置于本发明自制的提取净化装置中，冷凝回流、浓缩；

(4)样品检测：用步骤(1)所制备的样品萃取溶液溶解步骤(3)浓缩后的残留物，并过滤至色谱瓶中，利用hplc-ms进行检测，用内标法计算尿液中tsnas的值。

本发明优选的实施方案中，步骤(4)中的hplc-ms的检测条件为：

(1)色谱条件：色谱柱为watersacquityuplcbehc18色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；流动相a：乙腈，流动相b：0.01％乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序为：0～5min，流动相a由10％变为80％；6min，a由80％变为10％，平衡2min，总运行时间为8min；柱温：30℃，进样量：5.0μl，流速为：0.2ml/min；

(2)质谱条件：扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测mrm；电喷雾电压：3400v，离子源温度：110℃，雾化气：700l/hr；气帘气：70l/hr，碰撞气：0.19ml/min；扫描时间：100ms。各组分特征离子对选择及分析物测定最优参数见表1。

本发明优选的实施方案中，步骤(3)中自制的提取净化装置的结构如下：

烧瓶1，烧瓶1上设有第一接口3、第二接口4和螺纹接口2，烧瓶1通过第一接口3与隔热导气管5气流导通连接，隔热导气管5另一端与三通转接管7气流导通连接，三通转接管7的另外两个接口分别与密闭冷凝管10和样品筒8气流导通连接，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，样品筒8远离三通转接管7的一端设有筛板12并与固相萃取柱9气流导通连接，固相萃取柱9的另一端通过溶剂回流管6与第二接口4气流导通连接，溶剂回流管6内设有三通阀13。

本发明优选的实施方案中，固相萃取柱9中装填有碱性氧化铝14。

本发明优选的实施方案中，螺纹接口2与色谱进样瓶15可拆卸连接。

本发明优选的实施方案中，步骤(3)中的提取试剂为丙酮-氯仿的混合溶剂，其体积比为20:80。

本发明优选的实施方案中，隔热导气管5和溶剂回流管6采用软质材料，如pes；具有一定的伸缩性，方便操作过程中的组装连接。

本发明优选的实施方案中，样品筒8和固相萃取柱9为耐有机溶剂腐蚀的塑料材质，筛板12为塑料筛板或金属筛板，其余部件，例如烧瓶1、三通阀13以及密闭冷凝管10为玻璃材质。

本发明优选的实施方案中，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，当加热回流时提取装置中压力过高时可自动泄压，防止压力过高对装置造成破坏。

本发明优选的实施方案中，溶剂回流管6内设置三通阀13，可切换溶剂流回烧瓶1或者流出到烧瓶1外，实现样品回流提取和浓缩的切换。

本发明优选的实施方案中，提取装置中所有接口连接处均采用夹紧装置夹紧，接口带有密封环，保证提取装置在使用过程中的密封性，同时保证在泄压阀泄压的压力范围内各接口不会漏气。

本发明中提取净化装置的工作过程如下：

样品分析时，在固相萃取柱9中加入碱性氧化铝，在样品筒8中装入处理好的样品，在样品上方覆盖一层无水硫酸钠(用于除去溶剂及管道内的水分)，将样品筒8与固相萃取柱9密封连接，在烧瓶1中加入回流提取的溶剂，将固相萃取柱9通过溶剂回流管6与第二接口4密封连接，将隔热导气管5与第一接口3密封连接，将三通转接管7的三个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后将烧瓶置于水浴锅或油浴锅中加热冷凝回流。样品提取过程中，溶剂回流管6的三通阀13与第二接口4气流导通，挥发的溶剂将固相萃取柱9中所提取的待测样品回流至烧瓶1中，当样品提取完毕后，把三通阀13调整为与外界空气导通的状态，不断挥发的溶剂通过三通阀13流出并回收，此时烧瓶1中的溶液不断被浓缩直至溶剂蒸发完，然后用带有内标的样品萃取溶液溶解烧瓶中的残留物，即可进行hplc-ms检测。

本发明有益效果：

1、本发明自制一种带有固相萃取功能的索氏提取装置，该装置可在密闭条件下对样品进行分离提纯、浓缩，本发明无需像传统的分离提纯、浓缩需要多次转移、浓缩的操作步骤，大大提高了提取效率。

2、本发明自制的提取装置采用全封闭的冷凝管，有效避免了提取溶剂的挥发损失，大大降低了样品前处理过程对实验室环境造成的污染；并且，密闭冷凝器带有泄压阀，压力过高时可自动泄压，有效避免了可能因压力过高对提取装置造成的损坏。

3、本发明自制的提取装置中在溶剂回流管中设置三通阀，通过切换阀门可直接切换样品回流提取和浓缩，整个操作流程不需要转移样品；本装置中还设计了连接色谱进样瓶接口的圆底烧瓶，样品浓缩完成后，旋下色谱进样瓶即可直接进行分析，避免了常规样品尾管浓缩烧瓶浓缩完后，需用吸管把尾管中溶液取出并洗涤尾管和吸管的步骤。进一步简化了样品前处理操作。

4、本发明的装置采用碱性氧化铝基质固相分散处理，经过此装置处理的样品可在分离净化过程中除去大量杂质，且浓缩倍数可达200倍，方法可满足吸烟者尿液中超低含量tsnas的测定。

5、本发明方法采用超高效液相色谱技术，8min即可完成一个样品的分析，和常规液相色谱方法相比分离时间大大缩短，大大节约了仪器分析时间。

附图说明

图1是本发明自制提取净化装置的结构示意图；

图中附图标记含义如下：

1-烧瓶，2-螺纹接口，3-第一接口，4-第二接口，5-隔热导气管，6-溶剂回流管，7-三通转接管，8-样品筒，9-固相萃取柱，10-密闭冷凝管，11-泄压阀，12-筛板，13-三通阀，14-碱性氧化铝，15-色谱进样瓶。

具体实施方式

下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。

装置实施例1

自制的提取净化装置的结构如下：

烧瓶1，烧瓶1上设有第一接口3、第二接口4和螺纹接口2，烧瓶1通过第一接口3与隔热导气管5气流导通连接，隔热导气管5另一端与三通转接管7气流导通连接，三通转接管7的另外两个接口分别与密闭冷凝管10和样品筒8气流导通连接，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，样品筒8远离三通转接管7的一端设有筛板12并与固相萃取柱9气流导通连接，固相萃取柱9的另一端通过溶剂回流管6与第二接口4气流导通连接，溶剂回流管6内设有三通阀13。

本实施例中，固相萃取柱9中装填有碱性氧化铝14。

本实施例中，螺纹接口2与色谱进样瓶15可拆卸连接。

本实施例中，隔热导气管5和溶剂回流管6采用软质材料pes；具有一定的伸缩性，方便操作过程中的组装连接。

本实施例中，样品筒8和固相萃取柱9为耐有机溶剂腐蚀的塑料材质，筛板12为塑料筛板，其余部件，例如烧瓶1、三通阀13以及密闭冷凝管10为玻璃材质。

本实施例中，密闭冷凝管10上设有泄压阀11，当加热回流时提取装置中压力过高时可自动泄压，防止压力过高对装置造成破坏。

本实施例中，溶剂回流管6内设置三通阀13，可切换溶剂流回烧瓶1或者流出到烧瓶1外，实现样品回流提取和浓缩的切换。

本实施例中，提取装置中所有接口连接处均采用夹紧装置夹紧，接口带有密封环，保证提取装置在使用过程中的密封性，同时保证在泄压阀泄压的压力范围内各接口不会漏气。

本实施例中提取净化装置的工作过程如下：

样品分析时，在固相萃取柱9中加入碱性氧化铝，在样品筒8中装入处理好的样品，在样品上方覆盖一层无水硫酸钠(用于除去溶剂及管道内的水分)，将样品筒8与固相萃取柱9密封连接，在烧瓶1中加入回流提取的溶剂，将固相萃取柱9通过溶剂回流管6与第二接口4密封连接，将隔热导气管5与第一接口3密封连接，将三通转接管7的三个接口分别与样品筒8、密封冷凝管10和隔热导气管5密封连接，密封冷凝管10接通冷凝水，最后将烧瓶置于水浴锅或油浴锅中加热冷凝回流。样品提取过程中，溶剂回流管6的三通阀13与第二接口4气流导通，挥发的溶剂将固相萃取柱9中所提取的待测样品回流至烧瓶1中，当样品提取完毕后，把三通阀13调整为与外界空气导通的状态，不断挥发的溶剂通过三通阀13流出并回收，此时烧瓶1中的溶液不断被浓缩直至溶剂蒸发完，然后用带有内标的样品萃取溶液溶解烧瓶中的残留物，即可进行hplc-ms检测。

方法实施例1～3中tsnas的质谱参数如下：

表1tsnas的质谱参数

方法实施例1

(1)标准溶液的配制：分别称取0.1g的nnn，nnk，nat，nab于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml混合标准储备液，-20℃密封避光贮存；分别称取100mg的d⁴-nnn，d⁴-nnk，d⁴-nat，d⁴-nab于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml混合内标储备液，-20℃密封避光贮存；逐级稀释混合标准储备液得到6级标准工作溶液，对应各级浓度为：0.1ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml，然后加入混合内标储备液，使得各级标准工作液中的内标物浓度均为1.0ng/ml；样品萃取溶液为含1.0ng/ml内标的甲醇溶液，绘制标准工作曲线；

(2)样品前处理：准确量取一份重度吸烟者尿液样品80ml，浓缩至近干；然后在样品中加入4.0g的碱性氧化铝并使其与尿液充分研磨均匀，并在烘箱中烘干；

(3)样品提取、浓缩：在固相萃取柱9内填充8.0g氧化铝层，然后把样品与碱性氧化铝的混合物加入到样品杯8中，再在上面加2.0g的无水硫酸钠；装好样品后，用夹紧装置密封，并在烧瓶1中加入60ml丙酮-氯仿的混合溶剂，然后将上述样品提取净化装置放入水浴锅中在70℃下加热回流40min后提取样品。样品提取完后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1尾管中的样品溶液蒸发至近干，用0.5ml含内标的甲醇溶液溶解尾管中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，按选定色谱条件测定tsnas含量。

测定结果为：nab的含量为0.783pg/ml、nnn的含量为12.1pg/ml、nnk的含量为10.2pg/ml、nat的含量为0.533pg/ml。

方法实施例2

(1)标准溶液的配制：分别称取0.1g的nnn，nnk，nat，nab于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml混合标准储备液，-20℃密封避光贮存；分别称取100mg的d⁴-nnn，d⁴-nnk，d⁴-nat，d⁴-nab于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml混合内标储备液，-20℃密封避光贮存；逐级稀释混合标准储备液得到6级标准工作溶液，对应各级浓度为：0.1ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml，然后加入混合内标储备液，使得各级标准工作液中的内标物浓度均为1.0ng/ml；样品萃取溶液为含1.0ng/ml内标的甲醇溶液，绘制标准工作曲线；

(2)样品前处理：准确量取一份重度吸烟者尿液样品100ml，浓缩至近干；然后在样品中加入5.0g的碱性氧化铝和尿液充分研磨均匀，并在烘箱中烘干。

(3)样品提取、浓缩：在固相萃取柱9内填充10.0g氧化铝层，然后把样品与碱性氧化铝的混合物加入到样品杯8中，再在上面铺2.5g的无水硫酸钠。装好样品后，用夹紧装置密封，并在烧瓶1中加入100ml丙酮-氯仿的混合溶剂，然后将上述样品提取净化装置放入水浴锅中在75℃下加热回流45min后提取样品。样品提取完后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1中的样品溶液蒸发至近干，用0.5ml含内标的甲醇溶液溶解尾管中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，按选定色谱条件测定tsnas含量。

测定结果为：nab的含量为0.142pg/ml、nnn的含量为2.08pg/ml、nnk的含量为1.67pg/ml、nat的含量为0.114pg/ml。

方法实施例3

(1)标准溶液的配制：分别称取0.1g的nnn，nnk，nat，nab于100ml容量瓶中，用乙腈定容至浓度为1.0mg/ml混合标准储备液，-20℃密封避光贮存；分别称取100mg的d⁴-nnn，d⁴-nnk，d⁴-nat，d⁴-nab于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1mg/ml混合内标储备液，-20℃密封避光贮存；逐级稀释混合标准储备液得到6级标准工作溶液，对应各级浓度为：0.1ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml、5.0ng/ml、10.0ng/ml，然后加入混合内标储备液，使得各级标准工作液中的内标物浓度均为1.0ng/ml；样品萃取溶液为含1.0ng/ml内标的甲醇溶液，绘制标准工作曲线；

(2)样品前处理：准确量取一份普通吸烟者尿液样品120ml，浓缩至近干；然后在样品中加入6.0g的碱性氧化铝和尿液充分研磨均匀，并在烘箱中烘干。

(3)样品提取、浓缩：在固相萃取柱9内填充12.0g氧化铝层，然后把样品与碱性氧化铝的混合物加入到样品杯8中，再在上面铺3.0g的无水硫酸钠，装好样品后，用夹紧装置密封，并在烧,1中加入120ml丙酮-氯仿的混合溶剂，然后将上述样品提取净化装置放入水浴锅中在80℃下加热回流50min后提取样品，样品提取完后，打开三通阀13，让溶剂从溶剂回收口流出回收溶剂，直至烧瓶1尾管中的样品溶液增发到近干，用0.5ml含内标的甲醇溶解尾管中的残留物，溶液经针头过滤器过滤，按选定色谱条件测定tsnas含量。

测定结果为：nab的含量为0.372pg/ml、nnn的含量为6.41pg/ml、nnk的含量为5.38pg/ml、nat的含量为0.316pg/ml。