一种降钙素原检测试剂盒及其制备方法与流程

本发明属于医学检测
技术领域：
，尤其涉及一种降钙素原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：降钙素原(pct)是一种含116个氨基酸的无激素活性糖蛋白，在生理情况下由甲状腺-c细胞产生，含量极少，在健康人群的血清或脑脊液中几乎不能被检出，当严重细菌、真菌、寄生虫感染以及脓毒症和多脏器功能衰竭时它在血浆中的水平升高，是诊断和监测细菌炎性疾病感染的重要参数，因此具有重要的临床诊断和鉴别诊断价值。目前，针对降钙素原的检测方法有放射免疫学分析法、双抗夹心免疫化学发光法、透射免疫浊度法等，然而，放射免疫学分析法主要利用人工合成的多克隆抗体特异地识别和连接合成氨基酸降钙素原，能检测正常人的血清pct，可靠敏感度为4pm/ml，检测的是游离pct、结合型pct和降钙素基因相关肽前体的混合物，而不能区分上述三种物质，同时检测耗时长(19～22h)，而且有放射性元素的污染使用受到限制；双抗夹心免疫化学发光法是利用化学发光物质经氧化形成一个激发态的中间体，利用其回到稳定基态时的发光信号来间接测定pct浓度，存在发光效率低、标记物不稳定或者测试结果稳定性以及重复性差、成本高昂的问题。技术实现要素：本发明实施例提供一种降钙素原检测试剂盒，旨在解决现有降钙素原的检测方法存在检测效率低、成本高昂、测试结果不稳定且准确度低以及重复性差的技术问题。本发明实施例是这样实现的，一种降钙素原检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，其中，所述r1试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液5～7g/l；聚乙二醇600017～23g/l；表面活性剂0.9～1.2ml/l；防腐剂0.06～0.08g/l；所述r2试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液2～5g/l；抗人降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球630～660mg/l；聚乙二醇600017～23g/l；保护剂35～40g/l；防腐剂0.06～0.08g/l。本发明实施例还提供一种降钙素原检测试剂盒的制备方法，所述r1试剂的制备方法包括：按量称取磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及防腐剂，备用；将所述磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及防腐剂加入搅拌容器中，并加水至1l，搅拌均匀后，进行静置、过滤处理，即得；所述r2试剂的制备方法包括：按量配制磷酸盐缓冲液，将降钙素原抗体稀释至2～3mg/ml，得降钙素原抗体稀释液；向10～15g聚苯乙烯胶乳微球中加入8～13ml活化剂溶液，进行活化处理35～45分钟，得聚苯乙烯胶乳微球活化液；所述聚苯乙烯胶乳微球粒径为220～300nm；将所述聚苯乙烯胶乳微球活化液缓慢滴加入所述降钙素原抗体稀释液中，并于25～40℃下搅拌反应3～5h，得偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；向所述偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入聚乙二醇6000，并于25～40℃下进行封闭处理1～2h；将所述封闭处理后的悬浊液进行高速离心以及洗涤处理，并加入预称取好的保护剂以及防腐剂，同时加所述磷酸盐缓冲液至1l，搅拌均匀，即得。本发明实施例提供的降钙素原检测试剂盒，由r1试剂和r2试剂双试剂组成，通过r1试剂中双表面活性剂的添加，有效提高该试剂盒的稳定性，在2～8℃密避保存可稳定18个月，开启后在2～8℃避光可稳定2个月；另外，通过添加生物活性物质的保护剂，大大提高降钙素原抗体和胶乳微球偶联复合物的结合效率和稳定性，即通过使用与抗体共价结合的胶乳颗粒予以增强免疫沉淀反应，产生凝集以致浊度上升，从而大大提高了检测工作效率，同时检测结果重复性好，且精度高，最高检测范围可达到100ng/ml，具有很好的临床应用价值。附图说明图1是本发明实施例1试剂盒测试测试样本中的降钙素原含量的实测值与pct理论值的线性范围曲线图；图2是本发明实施例1试剂盒测试样本中的降钙素原含量的实测值与pct理论值的相关性曲线图。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明实施例提供的降钙素原检测试剂盒，由r1试剂和r2试剂双试剂组成，通过r1试剂中双表面活性剂的添加，有效提高该试剂盒的稳定性，在2～8℃密避保存可稳定18个月，开启后在2～8℃避光可稳定2个月；另外，通过添加生物活性物质的保护剂，大大提高降钙素原抗体和胶乳微球偶联复合物的结合效率和稳定性，即通过使用与抗体共价结合的胶乳颗粒予以增强免疫沉淀反应，产生凝集以致浊度上升，从而大大提高了检测工作效率，同时检测结果重复性好，且精度高，最高检测范围可达到100ng/ml。在本发明实施例中，抗人降钙素原抗体选购自菲鹏生物股份有限公司。在本发明实施例中，聚苯乙烯胶乳微球选购自jsr株式会社。在本发明实施例中，磷酸盐缓冲液为生物缓冲剂，为反应提供稳定的、适宜的ph环境。试剂储存时，为试剂提供一个良好的储存环境，保证试剂的有效储存；其中，所述r1试剂中磷酸盐缓冲液的ph值宜为6～7，优选6.5；所述r2试剂中磷酸盐缓冲液的ph值为7.5～8.5，优选8.0。在本发明实施例中，聚乙二醇的分子量为6000，其为环氧乙烷水解产物的聚合物，是一种非离子型的水溶性聚合物，具有水溶性、不挥发性、生理惰性、温和性等特性，作为分散剂和乳化剂，提高配制溶液和反应体系的均匀性和稳定性，提高抗原抗体结合物的反应浊度，提高试剂的灵敏度。在本发明实施例中，防腐剂为液体生物防腐剂proclin300或叠氮化钠，用于防止溶液中微生物生长，保持试剂的稳定性。在本发明实施例中，保护剂为海藻糖，作为生物活性物质的稳定剂和保护剂，提高降钙素原抗体和胶乳微球偶联复合物的结合效率和稳定性。在本发明实施例中，表面活性剂为吐温-20和/或十六烷基三甲基溴化铵，更优选地，所述表面活性剂为吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵，体积比为1:4。在本发明实施例中，活化剂溶液为羰基二咪唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，体积比为2:3。下面结合具体实施例详细说明本发明试剂盒，但这些实施例并不应认为是限制本发明的定义。实施例1一种降钙素原检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，其中，所述r1试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液5.2g/l；聚乙二醇600017.8g/l；表面活性剂0.9ml/l；液体生物防腐剂proclin3000.06g/l；所述表面活性剂为吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵，体积比为1:4。所述r1试剂的制备方法包括：按量称取磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及液体生物防腐剂proclin300，备用；将所述磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及液体生物防腐剂proclin300加入搅拌容器中，并加水至1l，搅拌均匀后，进行静置、过滤处理，即得。所述r2试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液2.5g/l；抗人降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球630mg/l；聚乙二醇600017.5g/l；海藻糖35g/l；液体生物防腐剂proclin3000.06g/l。所述r2试剂的制备方法包括：按量配制磷酸盐缓冲液，将降钙素原抗体稀释至2mg/ml，得降钙素原抗体稀释液；向10g聚苯乙烯胶乳微球中加入8ml活化剂溶液(羰基二咪唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，体积比为2:3)，进行活化处理35分钟，得聚苯乙烯胶乳微球活化液；所述聚苯乙烯胶乳微球粒径为220nm；将所述降钙素原抗体稀释液快速滴加入所述聚苯乙烯胶乳微球活化液中，并于25℃下搅拌反应3h，得到偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；向所述偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入聚乙二醇6000，并于25℃下进行封闭处理1h；将所述封闭处理后的悬浊液进行高速离心以及洗涤处理，并加入预称取好的海藻糖以及液体生物防腐剂proclin300，同时加所述磷酸盐缓冲液至1l，搅拌均匀，即得。实施例2一种降钙素原检测试剂盒，其特征在于，包括r1试剂和r2试剂，其中，所述r1试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液6.7g/l；聚乙二醇600023g/l；表面活性剂1.2ml/l；叠氮化钠0.08g/l；所述表面活性剂为吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵，体积比为1:4。所述r1试剂的制备方法包括：按量称取磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及叠氮化钠，备用；将所述磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及叠氮化钠加入搅拌容器中，并加水至1l，搅拌均匀后，进行静置、过滤处理，即得。所述r2试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液4.8g/l；抗人降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球660mg/l；聚乙二醇600023g/l；海藻糖40g/l；叠氮化钠0.06～0.08g/l。所述r2试剂的制备方法包括：按量配制磷酸盐缓冲液，将降钙素原抗体稀释至3mg/ml，得降钙素原抗体稀释液；向15g聚苯乙烯胶乳微球中加入13ml活化剂溶液(羰基二咪唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，体积比为2:3)，进行活化处理45分钟，得聚苯乙烯胶乳微球活化液；所述聚苯乙烯胶乳微球粒径为260nm；将所述降钙素原抗体稀释液快速滴加入所述聚苯乙烯胶乳微球活化液中，并于40℃下搅拌反应5h，得偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；向所述偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入聚乙二醇6000，并于40℃下进行封闭处理2h；将所述封闭处理后的悬浊液进行高速离心以及洗涤处理，并加入预称取好的海藻糖以及叠氮化钠，同时加所述磷酸盐缓冲液至1l，搅拌均匀，即得。实施例3一种降钙素原检测试剂盒，其特征在于，包括r1试剂和r2试剂，其中，所述r1试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液6.057g/l；聚乙二醇600020g/l；表面活性剂1ml/l；叠氮化钠0.07g/l；所述表面活性剂为吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵，体积比为1:4。所述r1试剂的制备方法包括：按量称取磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及叠氮化钠，备用；将所述磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及叠氮化钠加入搅拌容器中，并加水至1l，搅拌均匀后，进行静置、过滤处理，即得。所述r2试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液3.0285g/l；抗人降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球645mg/l；聚乙二醇600020g/l；海藻糖37g/l；叠氮化钠0.07g/l。所述r2试剂的制备方法包括：按量配制磷酸盐缓冲液，将降钙素原抗体稀释至2～3mg/ml，得降钙素原抗体稀释液；向13g聚苯乙烯胶乳微球中加入10ml活化剂溶液(羰基二咪唑和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，体积比为2:3)，进行活化处理40分钟，得聚苯乙烯胶乳微球活化液；所述聚苯乙烯胶乳微球粒径为330nm；将所述降钙素原抗体稀释液快速滴加入所述聚苯乙烯胶乳微球活化液中，并于30℃下搅拌反应4h，得偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液；向所述偶联降钙素原抗体的聚苯乙烯胶乳微球悬浊液中加入聚乙二醇6000，并于30℃下进行封闭处理1.5h；将所述封闭处理后的悬浊液进行高速离心以及洗涤处理，并加入预称取好的海藻糖以及叠氮化钠，同时加所述磷酸盐缓冲液至1l，搅拌均匀，即得。对比例1一种降钙素原检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述r1试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液5.2g/l；聚乙二醇600017.8g/l；液体生物防腐剂proclin3000.06g/l；所述r1试剂的制备方法包括：按量称取磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000以及液体生物防腐剂proclin300，备用；将所述磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000以及液体生物防腐剂proclin300加入搅拌容器中，并加水至1l，搅拌均匀后，进行静置、过滤处理，即得。对比例2一种降钙素原检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述r1试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液5.2g/l；聚乙二醇600017.8g/l；吐温-200.9ml/l；液体生物防腐剂proclin3000.06g/l。所述r1试剂的制备方法包括：按量称取磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、吐温-20以及液体生物防腐剂proclin300，备用；将所述磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、吐温-20以及液体生物防腐剂proclin300加入搅拌容器中，并加水至1l，搅拌均匀后，进行静置、过滤处理，即得。对比例3一种降钙素原检测试剂盒，包括r1试剂和r2试剂，与实施例1一致，区别在于：所述r1试剂包括以下组分：磷酸盐缓冲液6.057g/l；聚乙二醇600020g/l；表面活性剂1ml/l；叠氮化钠0.07g/l；所述表面活性剂为吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵，体积比为4:1。所述r1试剂的制备方法包括：按量称取磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及液体生物防腐剂proclin300，备用；将所述磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、表面活性剂以及液体生物防腐剂proclin300加入搅拌容器中，并加水至1l，搅拌均匀后，进行静置、过滤处理，即得。为进一步说明本发明的技术效果，下面对本发明实施例提供的降钙素原检测试剂盒的性能评价进行详细说明：检测样本：新鲜血清，空腹采血后应及时分离，避免溶血。血清2-8℃保存，样本可稳定7天；-20℃保存，样本可稳定一个月。样本不可以反复冻融。检验方法：本发明实施例提供的降钙素原检测试剂盒采用双试剂(r1试剂和r2试剂)，使用时，双试剂无需配置，可直接使用。试验条件详见下表1，在具体应用中，可根据不同检测仪器索取不同的上机参数。表1试验条件主波长510nm校正类型非线性样本/r1/r215/180/60μl方法两点终点法校正方法多点定标反应方向向上操作步骤：向15μl样本中加入180μl的r1试剂，混匀，37℃孵育3～5分钟，加入r2试剂60μl，混匀，37℃孵育约10-20s，读吸光度值a1，继续孵育约5min，读吸光度值a2，计算吸光度之差δa＝a2-a1。校准程序：多点定标曲线非线性拟合处理，测定方法同样本。质量控制程序：控制相对偏差在性能指标范围内。试验结果的计算：多点定标，以样条函数作为计算模式绘制标准曲线，样本中pct含量可根据其吸光度值在标准曲线上算出。按照上述检测标准，对实施例1-3以及对比例1-3所得试剂盒进行性能测试。1、线性范围在贝克曼au480全自动生化分析仪上进行试验：向15μl样本中加入180μl的r1试剂，混匀，37℃孵育3～5分钟，加入r2试剂60μl，混匀，37℃孵育约10-20s，读吸光度值a1，继续孵育约5min，读吸光度值a2，为了减少偶然误差重复测定三次取平均值，计算吸光度之差δa＝a2-a1。取临床高值标本，将高值标本按照以下浓度梯度进行加水稀释：0、1/8、1/4、2/4、3/4、1，采用本发明实施例1-3所得试剂对每个浓度梯度的样本进行测试，每个样品测3次，取平均值数据记录如下表2.表2(单位：ng/ml)同时，根据表2，以pct理论值作为纵坐标，实施例1测试所得pct实测均值为横坐标，做相关性曲线(图1)，得到的相关性曲线为y＝0.9806x+0.5106，r2≥0.9994。结合上表2的试验结果可以看出，本发明试剂盒的最高检测范围可达100ng/ml，判定依据r2≥0.990。2、稳定性测试(1)开瓶稳定性将本发明实施例1-3以及对比例1-3所得试剂盒试剂进行稳定性试验，以实施例1的试剂盒为例，将试剂盒中的每种试剂开口放置2～8℃冰箱内，选取一临床常规高值血清标本和低值血清标本放置于-20℃冰箱内保存，每隔10天采用上述双试剂分别测定上述高值血清标本(浓度约17ng/ml)和低值血清标本(浓度约0.35ng/ml)的降钙素原含量，每份试样重复检测3次，记录其平均值，连续监测60天，以第0天的检测结果均值作为基准，计算第60天检测结果的均值与第0天检测结果均值的相对偏差。数据记录如下表3-4所示，标本1：低值血清样本，标本2：高值血清样本。其余实施例的稳定性测试参照上述实施例1的测试方法。表3实施例1-3所得试剂盒开瓶稳定性(单位：ng/ml)表4对比例1-3所得试剂盒开瓶稳定性(单位：ng/ml)从上表3-4的试验结果可以得出，r1试剂中添加表面活性剂可以明显提高试剂的稳定性，单独添加吐温-20的试剂稳定性相对比按体积比4:1添加吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵的试剂效果要好，而按体积比1:4添加吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵的试剂稳定性最好，测值相对偏差均≤15％，由此可以得出，吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵具有协同作用，可以共同提高试剂的稳定性，开瓶稳定性长达60天。(2)效期稳定性将本发明实施例1-3以及对比例1-3所得试剂盒试剂进行稳定性试验，以实施例1的试剂盒为例，将试剂盒放置2-8℃，选取一组临床高值血清标本和一组临床低值血清标本分别混匀、分装放置于-20℃冰箱内保存，每隔3个月采用上述双试剂分别测定上述高值血清标本和低值血清标本的降钙素原含量，每份试样重复检测3次，记录其平均值，连续监测18个月，数据记录如下表5-6所示，标本1：低值血清样本，标本2：高值血清样本。其余实施例的稳定性测试参照上述实施例1的测试方法。表5实施例1-3所得试剂盒试剂效期稳定性(单位：ng/ml)表6对比例1-3所得试剂盒试剂效期稳定性(单位：ng/ml)从上表5-6的试验结果可以进一步得出，r1试剂中添加表面活性剂可以明显提高试剂的稳定性，单独添加吐温-20的试剂稳定性相对比按体积比4:1添加吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵的试剂效果要好，而按体积比1:4添加吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵的试剂稳定性最好，测值相对偏差均≤15％。由此可以得出，吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵具有协同作用，可以共同提高降钙素原检测试剂盒试剂的稳定性，有效期长达18个月。3、精密度试验选取临床上的一个低值的降钙素原含量的样品和一个高值的降钙素原含量的样品，采用本发明实施例1提供的降钙素原检测试剂盒进行精密度测试(包括批内精密度和批间精密度)，重复测定20次，计算变异系数，数据记录如下表7所示。批内精度：同一生产批号的试剂盒；样品1：低值样本；样品2：高值样本。批间精度：不同生产批号的同一款试剂盒。表7实施例1所得试剂盒的批内精密度以及批间精密度(单位：ng/ml)从上表7的试验结果可以得出，采用本发明实施例1提供的降钙素原检测试剂盒试剂测定的变异系数(cv％)，批内精密度和批间精密度均小于6％，即具有良好的精密度。4、样本相关性测试随机选取临床上的40例血清标本，标本浓度范围分布为低、中、高全覆盖，检测三次取平均值，以本发明实施例1为例做详细说明，记录如下表8。测定步骤：选择实施例1降钙素原试剂盒和罗氏电化学发光法检测试剂检测上述随机选取临床的40例血清标本，检测结果如下。表8(单位：ng/ml)同时，根据表8，以pct的罗氏电化学发光法试剂和采用本发明实施例1的试剂测试血清样本中的降钙素原含量的实测值做相关性曲线(图2)，x轴表示实施例1测值，y轴表示电化学发光法测值，得到相关性曲线方程为：y＝0.9839x-0.6135，相关系数r2＝0.9985。可见本发明实施例1提供的降钙素原检测试剂盒的检测结果与电化学发光法试剂的检测结果具有相关性良好。综上，本发明实施例提供的降钙素原检测试剂盒，由r1试剂和r2试剂双试剂组成，通过r1试剂中双表面活性剂的添加，有效提高该试剂盒的稳定性，在2～8℃密避保存可稳定18个月，开启后在2～8℃避光可稳定2个月；另外，通过添加生物活性物质的保护剂，大大提高降钙素原抗体和胶乳微球偶联复合物的结合效率和稳定性，即通过使用与抗体共价结合的胶乳颗粒予以增强免疫沉淀反应，产生凝集以致浊度上升，从而大大提高了检测工作效率，同时检测结果重复性好，且精度高，最高检测范围可达到100ng/ml，具有很好的临床应用价值。值得注意的是，本发明实施例与对比例的区别在于：本发明实施例均采用双表面活性剂，而对比例1无添加表面活性剂，对比例2采用单表面活性剂以及对比例3采用不同双表面活性剂比例，表面活性剂的添加作用在于增加乳剂的稳定性，提高反应体系的反应效率，测试结果表明：双表面活性剂体系可显著提高降钙素原检测试剂盒的稳定性，同时，双表面活性剂中吐温-20与十六烷基三甲基溴化铵的体积比对试剂盒的稳定性也影响显著。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12