动物源性食品中磺胺类药物快速筛查试剂盒的制作方法

本发明涉及到一种快速筛查试剂盒，具体涉及检测动物食用组织/卵和动物乳中磺胺类药物残留的酶联免疫试剂盒及其检测应用。
背景技术：
：磺胺类药物(sulfonamides,sas)是一大类具有对氨基苯磺酰胺结构药物的总称，被用于细菌感染性疾病的预防和治疗。磺胺类药物具有广谱的抗菌性、药效持续稳定、便宜易获取等优点，在饲料添加剂与作为动物治疗药一直存在很大隐患。该药物进入动物体内，可蓄积在肉、卵和乳中，最终经人食用进入人体富集。从而，导致人体产生变态、过敏反应，产生细菌性感染耐药性，至致畸、致突变、致癌等严重后果。有研究报到，欧盟甚国家中部分猪肉磺胺类药物平均使用量达到4.82mg/kg，牛肉为17.2mg/kg，鸡肉为0.033mg/kg，鱼肉为58.5mg/kg；磺胺类药物在各类食品中的检出率高达20%。动物源性食品检出残留，一方面，残留的药物对人体产生极大危害；另一方面，兽药残留也阻碍了动物源性食品的进出口贸易。因而，动物源性食品中兽药残留对人体健康的影响已成为食品安全问题之一。兽药在缺乏有效监管的情况下被过分滥用，导致许多动物源性食品中大量残留。我国农业部及欧美国家都规定了磺胺类在动物性食品中的最高残留限量0.1mg/kg。目前，对磺胺类药物残留检测主要通过液质联用（hplc-ms）、高效液相色谱法（hplc）、高效毛细管电泳法（hpce）。三者相对专业操作强、大型仪器难以实现市场普及、快速检测难以实现等问题。面临这些困难开发一种能够实现快速方便、经济易行、实现大批量检测的试剂盒非常有必要。本发明旨在开发一种动物源性食品中磺胺类药物快速筛查试剂盒。技术实现要素：本发明拟提供一种专门针对动物源性食品中磺胺类药物残留检测的试剂盒，并提供一种高效、准确、简便、满足大批量样本筛选的定性、定量检测和试剂盒制备方法。本发明所述的磺胺类药物残留检测试剂盒，其主要包含以下试剂：包被磺胺类药物偶联抗原的酶标板、磺胺类药物标准溶液、磺胺类药物单克隆抗体-碱性磷酸酶（ap）工作液、显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液所组成。本发明所述的酶标板制备具体步骤包括：1)将磺胺类半抗原与载体蛋白偶联得到包被抗原；2)用碳酸盐缓冲液稀释包被抗原，100μl/孔，4℃包被过夜；3)取出酶标板洗涤1次，拍干，加入含酪蛋白的pbs缓冲液，150μl/孔，37℃封闭2-3h；4)酶标板封闭结束，洗涤3-5次，拍干后放置25℃恒温晾干，抽检合格后将酶标板真空包装，4℃保存。本发明所述磺胺类药物标准溶液浓度分别为0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、9ng/ml、27ng/ml、81ng/ml。本发明所述磺胺类药物单克隆抗体-ap工作液是将磺胺类免疫抗原经人工免疫balb/c小鼠，制备能够稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，由细胞株分泌纯化得到单克隆抗体，单克隆抗体与碱性磷酸酶经戊二醛法或碘酸钠法制备获得。本发明所述显色液包括试剂a/b/c，试剂a为10%二乙醇胺缓冲液，试剂b为5%对硝基苯磷酸二钠（pnpp）缓冲液，试剂c为0.01%氯化镁tris-bace缓冲液。所述终止液为0.1mol/l氢氧化钠，所述浓缩洗涤液为20倍浓缩洗涤液，具体是含0.5%tween-20的0.2mol/lpbs，所述浓缩复溶液为为20倍浓缩复溶液，具体是0.1-0.2mol/lpbs，所述百分数均为质量分数。本发明所述试剂盒基于抗原抗体免疫反应，其检测方法主要包括以下步骤：1)样品前处理，将样品中待测药物通过有机溶剂提取出来；2)将所有试剂与酶标板回温至20-25℃；3)加标准品/样本和磺胺类药物单克隆抗体-ap工作液：加标准品/样本50ml到对应的微孔中，然后加入磺胺类药物单克隆抗体-ap工作液50ml/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应45min；4)洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤3-5次，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干；5)显色：取a液250μl，加入到盛有10mlc液管内，再加入b液300μl，充分混匀；轻轻混合即可，每孔加入100μl，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应10min；6)检测：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于405nm检测每孔od值。本发明所述样品前处理方法主要包括以下方式：动物组织：称取2.0g均质后的组织样本加入1ml0.2m磷酸盐缓冲溶液涡旋成糊状，加入9ml乙腈-乙酸乙酯振荡均一，5000r/min离心5min；上层有机相水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷和1ml复溶工作液，5000r/min离心5min；取下层水相用于分析。动物卵：均质器均质蛋清和蛋黄充分混合；称取2.0g均质后的组织样本，加入10ml乙腈振荡10min，5000r/min离心5min；上层有机相水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷和1ml复溶工作液，5000r/min离心5min；取下层水相用于分析。动物乳：将样品5000r/min离心5min至样品清亮；移取200ml清亮样品加入800ml复溶液混匀用于分析。本发明其检测动物源性食品中磺胺类药物残留的测定原理是样品中的磺胺类药物与酶标板上固定的包被抗原特异性竞争结合磺胺类药物单克隆抗体-ap，通过酶催化酶底物显色，根据吸光度值大小结合标准曲线来检测样品中磺胺类药物残留量。如果样品中磺胺类药物残留多，显色浅吸光度值低；反之，则颜色深吸光度值高。本发明动物源性食品中磺胺类药物快速筛查试剂盒采用抗原抗体特异性竞争反应，能够达到定性、定量，对样品前处理简单易行，操作简单，能够适用于大规模样品检测需求。附图说明附图说明图1磺胺类药物残留的标准曲线。具体实施方式实施例一：磺胺类药物快速筛查试剂盒各组分制备1、磺胺类药物抗原制备及鉴定称取34.4mg半抗原溶解于8mldmf溶液中，加入edc和nhs活化30min，加入150-300mg载体蛋白4℃搅拌偶联过夜，得到磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物；偶联后用0.01mol/lpbs缓冲液透析3d，以除去未偶联的小分子物质，透析完成后，分装-20℃保存。将载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物半抗原-载体蛋白偶联物用ph7.4的pb配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/lph7.4的pb调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围内扫描。得到载体蛋白、磺胺类药物半抗原、磺胺类药物抗原半抗原-载体蛋白偶联物的吸收曲线。结果显示三者出现不同的吸收曲线，表明磺胺类药物半抗原与载体蛋白偶联成功。本发明所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、蓝血蛋白、人血清蛋白、鼠血清蛋白。2、磺胺类药物单克隆抗体制备动物免疫：磺胺类药物抗原免疫8-10周balb/c小鼠；细胞融合与克隆化：取免疫后balb/c小鼠脾脏细胞，与sp2/0细胞在50%peg融合剂作用下融合，通过有限稀释法筛选分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株；细胞冻存和复苏：将杂交瘤细胞冻存为1×109个/ml细胞悬液，逐级冷冻最终保存到液氮中；复苏时取出冻存管，在42℃水浴中速溶，离心后移入培养瓶培养；抗体制备与纯化：杂交瘤细胞置于培养瓶，在37℃，5%co2培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将培养液进行纯化，得到单克隆抗体，分装-20℃保存。3、磺胺类药物单克隆抗体-碱性磷酸酶的制备称取2mgap溶解于0.5ml双蒸水中，加入0.5ml新配置的0.05mol/lnaio4溶液，4℃避光反应30min；加入200mmol/l的乙二醇0.5ml，室温反应30min；加入磺胺类药物单克隆抗体2mg，混匀后用0.05mol/lpbs透析过夜；透析液加入0.25ml新配置的0.5%nabh4溶液，4℃静置4h,；加入等体积饱和硫酸铵，4℃静置2h，4℃，5000r/min离心30min，取沉淀；将沉淀溶解于ph=8.0的0.05mol/lpbs缓冲液，用0.01mol/lpbs4℃透析过夜；透析液4℃，10000r/min离心30min取上清，加入等体积甘油，分装-20℃保存。实施例二：磺胺类药物快速筛查试剂盒组建磺胺类药物快速筛查试剂盒包含下述给组分：1)包被有磺胺类药物偶联抗原的酶标板；2)标准溶液6瓶，浓度分别为0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、9ng/ml、27ng/ml、81ng/ml；3)磺胺类药物单克隆抗体-碱性磷酸酶（ap）工作液；4)显色液试剂a/b/c，试剂a为10%二乙醇胺缓冲液，试剂b为5%对硝基苯磷酸二钠（pnpp）缓冲液，试剂c为0.01%氯化镁tris-bace缓冲液；5)终止液为0.1mol/l氢氧化钠；6)浓缩洗涤液为20倍浓缩洗涤液，具体是含0.5%tween-20的0.2mol/lpbs；7)浓缩复溶液为为20倍浓缩复溶液，具体是含2-5%酪蛋白0.1-0.2mol/lpbs。本发明所述试剂盒检测方法简单易行，一步加样后显色，所用时间短，能够实现大量快速样品检测需求。实施例三：磺胺类药物快速筛查试剂盒样本检测1、试剂配置显色液：使用前取250mla液与300mlb液加入到10mlc液中混匀；终止液：称取4g氢氧化钠溶解到1l去离子水中；洗涤工作液：浓缩洗涤液：去离子水按1:19比例稀释；复溶工作液：浓缩复溶液：去离子水按1:19比例稀释；乙腈-乙酸乙酯溶液：两者按1:1混匀；0.2m磷酸盐缓冲溶：称取25.8g十二水合磷酸氢二钠和4.35g二水合磷酸二氢钠加入500ml去离子水溶解混匀。2、样品前处理动物组织：称取2.0g均质后的组织样本加入1ml0.2m磷酸盐缓冲溶液涡旋成糊状，加入9ml乙腈-乙酸乙酯振荡均一，5000r/min离心5min；上层有机相水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷和1ml复溶工作液，5000r/min离心5min；取下层水相用于分析。动物卵：均质器均质蛋清和蛋黄充分混合；称取2.0g均质后的组织样本，加入10ml乙腈振荡10min，5000r/min离心5min；上层有机相水浴氮气流下吹干，加入1ml正己烷和1ml复溶工作液，5000r/min离心5min；取下层水相用于分析。动物乳：将样品5000r/min离心5min至样品清亮；移取200ml清亮样品加入800ml复溶液混匀用于分析。3、检测步骤加样：加标准品/样本50ml到微孔，再加入磺胺类药物单克隆抗体-碱性磷酸酶工作液，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜置25℃避光反应45min；洗涤：将孔内液体倒出，用洗涤工作液250ml/孔，充分洗涤3-5次，拍干；加显色液：每孔加入新配置显色液100ml，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜置25℃避光反应10min；检测：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于405nm检测每孔od值；4、结果分析百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准品（0标准）的吸光度值的平均值，再乘以100%，即百分吸光率（%）=×100%b—标准品或样本溶液的平均吸光度值，b0—0ppb标准溶液的平均吸光度值。以磺胺类标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，标准品百分吸光度率为纵坐标，绘制标准曲线，求出线性方程。将样本的百分吸光率代入标准曲线，从标准曲线读出样本对应浓度，乘以稀释倍数即为样本中磺胺类残留的浓度。实施例四：试剂盒准确定和精密度测试按照实施例三中样本提取方法，以10μg/kg、20μg/kg、40μg/kg三个浓度的磺胺类药物分别对猪肉、鸡肉、鱼肉、虾肉、鸡蛋、牛奶样本进行添加回收，每种样本每个浓度各3个平行，用三批试剂盒进行测定计算样本的回收率及变异系数。实验结果见下表：表1磺胺类药物样品检测由表可知，六类样品中磺胺类药物添加平均回收率范围在76.8%-106.5%之间，批内、批间变异系数均<10%。实施例五：试剂盒特异性测试特异性是指交叉反应率，抗体与抗原发生结合的能力强弱。通过测定磺胺类药物ic50值，选择不同磺胺药物类似结构的药物测定ic50值，计算交叉反应率来判断试剂盒检测的特异性。交叉反应率（%）=×100%计算结果如下表所示：表2磺胺类药物交叉反应率药物名称交叉反应率/%磺胺嘧啶100磺胺甲基异噁唑93磺胺二甲基嘧啶236磺胺甲噻二唑80磺胺喹噁啉86磺胺甲基嘧啶152磺胺间甲氧嘧啶251磺胺苯酰273磺胺对甲氧基嘧啶240磺胺异噁唑85酞酰磺噻唑21磺胺噻唑19当前第1页12