一种四环素多克隆抗体及其制备方法与流程

本发明涉及四环素多克隆抗体领域，具体涉及一种四环素多克隆抗体的制备方法。

背景技术：

随着集约化畜牧业的发展，兽药的应用范围也在不断扩大，如抗生素、维生素、磺胺药、激素、金属微量元素等已广泛用于促进肉用畜禽的生长、减少发病率和提高饲料利用率、促进母畜同期发情等，但是长期以来我国处于食品特别是动物源性食品供应不足的状态，养殖业生产主要以增加动物源性食品的数量、满足市场的需求为主，对包括动物源性食品药物残留在内的食品安全问题重视不够。在对药物残留的要求、兽药的法律法规、兽药的使用和控制以及残留监控体系等方面还存在严重问题，尚未建立全国范围统一协调的监控检测体系，还不能做到对动物源性食品进行全过程监管。目前，我国动物源性食品药物残留超标影响食品安全、危害人体健康的问题非常突出。

抗生素残留主要是由于不合理使用药物治疗动物疾病和作为饲料药物添加剂而引起的，由于抗生素和其他一些兽药既能预防和治疗许多病原微生物感染引起的疾病，又能促进动物生长，一些养殖场或养殖户为了达到防病治病减少动物死亡的目的，违反国家规定，在饲料中超剂量使用或滥用兽药和其他违禁药品，甚至实行药物与日粮同步。例如，盐酸克伦特罗有促进动物肌肉生长，降低桐体脂肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉产量的作用，一些不法分子为了追求经济利益，在饲养中大量使用氯霉素是己禁用的抗生素，但因成本低廉，长期以来不少饲养户将其大量添加在畜禽饲料中。

技术实现要素：

针对以上问题，本发明提供了一种四环素多克隆抗体及其制备方法，以盐酸四环素和丁胺卡那霉素为主要原料，加入一定量的浓盐酸、玻拍酞亚胺、四环素半抗原，采用碳二亚胺两步合成法制备出对抗生素敏感的抗体，在适当条件下所产生的抗体和药物浓度成比例关系，原理及操作简单、灵敏度较高，具有优良的生物性能，可以有效解决背景技术中的问题。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种四环素多克隆抗体，按照重量份数由如下原料制成：

四环素标准品58-60份、丁胺卡那霉素5-20份、牛血清白蛋白3-5份、卵清蛋白3-6份、碳二亚胺盐酸盐1-5份、N-羚基唬拍酞亚胺2-8份、二甲基甲酞胺1-2份、完全弗式佐剂1-3份、不完全弗式佐剂2-3份、磷酸盐缓冲液8-10份、碳酸盐缓冲液15-20份、包被缓冲液10-15份、洗涤液8-12份、显色剂8-13份、过氧化物酶标记羊抗鼠1-3份、硫酸1-3份。

根据上述技术方案，所述缓冲液选择PH值为9.6，浓度为0.05mol/ml的碳酸盐缓冲液，定容至100ml。

根据上述技术方案，所述硫酸选择浓度为2mol/ml的溶液。

根据上述技术方案，所述显色剂选择过氧化氢水溶液。

根据上述技术方案，所述洗涤液的浓度为0.01mol/ml，PH值为7.0。

另外本发明还设计了一种四环素多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：

（1）取用10g盐酸四环素溶于有2ml浓盐酸的500ml水中，室温搅拌下，再加入7g粉末状玻拍酞亚胺，反应30分钟后，水洗过滤；

（2）将得到的粗产品溶于80ml 95%的乙醇中，溶解完全后，将其加入到80ml加有水合阱的乙醇溶液中，混合物立刻沉淀，搅拌1h，放置过夜，过滤得产品；

（3）采用碳二亚胺两步法合成四环素免疫原：

a：准确称取BSA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于4ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ml DMF和3ml PBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

（4）采用碳二亚胺两步法合成四环素的包被原：

a：准确称取OVA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于5ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ulDMF和3mlPBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

根据上述技术方案，所述步骤（1）中，水洗过滤的次数最少在3次以上。

根据上述技术方案，所述步骤（3）和步骤（4）中，反应液透析的调节分为三段，恒温透析、换液处理、以及反应液降温处理。

根据上述技术方案，所述恒温透析阶段的温度从恒定在4℃，在密封避光的条件下搅拌过夜；所述换液处理阶段的温度保持在4℃不变，但是要对透析液每8h换液1次；所述反应液降温处理阶段，在透析完成后，将反应液置于-20℃的环境下保存备用。

本发明的有益效果：

本发明以盐酸四环素和丁胺卡那霉素为主要原料，加入一定量的浓盐酸、玻拍酞亚胺、四环素半抗原，采用碳二亚胺两步合成法制备出对抗生素敏感的抗体，在适当条件下所产生的抗体和药物浓度成比例关系，原理及操作简单、灵敏度较高，具有优良的生物性能。

附图说明

图1为本发明利用紫外扫描方法鉴定载体蛋白的关系曲线图。

图2为本发明利用紫外扫描方法鉴定半抗原的关系曲线图。

图3为本发明小鼠效价与免疫次数的关系图。

图4为本发明小鼠抗血清效价的关系图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

一种四环素多克隆抗体的配方，按照重量份数由如下原料组成：

四环素标准品58份、丁胺卡那霉素5份、牛血清白蛋白3份、卵清蛋白3份、碳二亚胺盐酸盐1份、N-羚基唬拍酞亚胺2份、二甲基甲酞胺1份、完全弗式佐剂1份、不完全弗式佐剂2份、磷酸盐缓冲液8份、碳酸盐缓冲液15份、包被缓冲液10份、洗涤液8份、显色剂8份、过氧化物酶标记羊抗鼠1份、硫酸1份。

所述缓冲液选择PH值为9.6，浓度为0.05mol/ml的碳酸盐缓冲液，定容至100ml；所述硫酸选择浓度为2mol/ml的溶液；所述显色剂选择过氧化氢水溶液；所述洗涤液的浓度为0.01mol/ml，PH值为7.0。

其制备方法，包括如下步骤：

（1）取用10g盐酸四环素溶于有2ml浓盐酸的500ml水中，室温搅拌下，再加入7g粉末状玻拍酞亚胺，反应30分钟后，水洗过滤；

（2）将得到的粗产品溶于80ml 95%的乙醇中，溶解完全后，将其加入到80ml加有水合阱的乙醇溶液中，混合物立刻沉淀，搅拌1h，放置过夜，过滤得产品；

（3）采用碳二亚胺两步法合成四环素免疫原：

a：准确称取BSA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于4ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ml DMF和3ml PBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

（4）采用碳二亚胺两步法合成四环素的包被原：

a：准确称取OVA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于5ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ml DMF和3ml PBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

所述产品水洗过滤的次数最少在3次以上，在步骤（3）和步骤（4）中，反应液透析的调节分为三段，恒温透析、换液处理、以及反应液降温处理，所述恒温透析阶段的温度从恒定在4℃，在密封避光的条件下搅拌过夜；所述换液处理阶段的温度保持在4℃不变，但是要对透析液每8h换液1次；所述反应液降温处理阶段，在透析完成后，将反应液置于-20℃的环境下保存备用。

实施例2：

一种四环素多克隆抗体的配方，按照重量份数由如下原料组成：

四环素标准品59份、丁胺卡那霉素12.5份、牛血清白蛋白4份、卵清蛋白4.5份、碳二亚胺盐酸盐3份、N-羚基唬拍酞亚胺5份、二甲基甲酞胺1.5份、完全弗式佐剂2份、不完全弗式佐剂2.5份、磷酸盐缓冲液9份、碳酸盐缓冲液17.5份、包被缓冲液12.5份、洗涤液102份、显色剂10.5份、过氧化物酶标记羊抗鼠2份、硫酸2份。

所述缓冲液选择PH值为9.6，浓度为0.05mol/ml的碳酸盐缓冲液，定容至100ml；所述硫酸选择浓度为2mol/ml的溶液；所述显色剂选择过氧化氢水溶液；所述洗涤液的浓度为0.01mol/ml，PH值为7.0。

其制备方法，包括如下步骤：

（1）取用10g盐酸四环素溶于有2ml浓盐酸的500ml水中，室温搅拌下，再加入7g粉末状玻拍酞亚胺，反应30分钟后，水洗过滤；

（2）将得到的粗产品溶于80ml 95%的乙醇中，溶解完全后，将其加入到80ml加有水合阱的乙醇溶液中，混合物立刻沉淀，搅拌1h，放置过夜，过滤得产品；

（3）采用碳二亚胺两步法合成四环素免疫原：

a：准确称取BSA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于4ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ml DMF和3ml PBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

（4）采用碳二亚胺两步法合成四环素的包被原：

a：准确称取OVA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于5ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ml DMF和3ml PBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

所述产品水洗过滤的次数最少在3次以上，在步骤（3）和步骤（4）中，反应液透析的调节分为三段，恒温透析、换液处理、以及反应液降温处理，所述恒温透析阶段的温度从恒定在4℃，在密封避光的条件下搅拌过夜；所述换液处理阶段的温度保持在4℃不变，但是要对透析液每8h换液1次；所述反应液降温处理阶段，在透析完成后，将反应液置于-20℃的环境下保存备用。

实施例3：

一种四环素多克隆抗体的配方，按照重量份数由如下原料组成：

四环素标准品60份、丁胺卡那霉素20份、牛血清白蛋白5份、卵清蛋白6份、碳二亚胺盐酸盐5份、N-羚基唬拍酞亚胺8份、二甲基甲酞胺2份、完全弗式佐剂3份、不完全弗式佐剂3份、磷酸盐缓冲液10份、碳酸盐缓冲液20份、包被缓冲液15份、洗涤液12份、显色剂13份、过氧化物酶标记羊抗鼠3份、硫酸3份。

所述缓冲液选择PH值为9.6，浓度为0.05mol/ml的碳酸盐缓冲液，定容至100ml；所述硫酸选择浓度为2mol/ml的溶液；所述显色剂选择过氧化氢水溶液；所述洗涤液的浓度为0.01mol/ml，PH值为7.0。

其制备方法，包括如下步骤：

（1）取用10g盐酸四环素溶于有2ml浓盐酸的500ml水中，室温搅拌下，再加入7g粉末状玻拍酞亚胺，反应30分钟后，水洗过滤；

（2）将得到的粗产品溶于80ml 95%的乙醇中，溶解完全后，将其加入到80ml加有水合阱的乙醇溶液中，混合物立刻沉淀，搅拌1h，放置过夜，过滤得产品；

（3）采用碳二亚胺两步法合成四环素免疫原：

a：准确称取BSA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于4ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ml DMF和3ml PBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

（4）采用碳二亚胺两步法合成四环素的包被原：

a：准确称取OVA 40.8mg、EDC 34.47g、NHS 13.81mg，使之充分溶解于5ml PBS中，放入磁力搅拌器转子，密封烧杯，室温下搅拌反应24h，得到的反应液，称为A液；

b：准确称取四环素半抗原12.87mg，加入300ml DMF和3ml PBS使之充分溶解，称为B液；

c：然后将B液逐滴滴加到A液中，密封避光，在4℃下搅拌过夜。待上述反应完成后，将反应液转移至处理好的透析袋中，于4℃冰箱中，搅拌下用PBS透析72h，前24h每8h换液1次，透析完成后将透析后的交联产物分装，于-20℃保存备用。

所述产品水洗过滤的次数最少在3次以上，在步骤（3）和步骤（4）中，反应液透析的调节分为三段，恒温透析、换液处理、以及反应液降温处理，所述恒温透析阶段的温度从恒定在4℃，在密封避光的条件下搅拌过夜；所述换液处理阶段的温度保持在4℃不变，但是要对透析液每8h换液1次；所述反应液降温处理阶段，在透析完成后，将反应液置于-20℃的环境下保存备用。

实施例4

通过以下测试方法对四环素人工抗原性能进行鉴定。

（1）利用紫外扫描方法鉴定四环素人工抗原的性能（如图1、2所示）

先用PBS精确配制适宜浓度的四环素半抗原与标准溶液，然后量取一定量的TC-BSA储备液稀释适宜倍数后，用考马斯亮蓝染色法测定偶联物中蛋白质浓度。用紫外分光光度计测出四环素与BSA的最大吸收波长，并取得各自最大吸收波长处的吸光值，然后在它们各自的最大波长下测与标准BSA相同浓度的TC-BSA的吸光度，并且作紫外光谱扫描。

由图1、2可以看出，在PBS中，半抗原在285nm和345nm处有典型吸收，另外，BSA和OVA的做大波长为278nm，其在300-400nm无吸收，而结合物的紫外光谱在300nm后有很大的紫外吸收，光谱明显具有TC和蛋白叠加的特征，并且相同浓度的结合物和标准蛋白的紫外光谱相比较，吸光度明显增高，推其原因只能是四环素与蛋白偶联上，通过计算，免疫原与包被原的结合比分别为4：1和3：1。

（2）动物免疫试验鉴定四环素人工抗原的性能（如图3、4所示）

选择小鼠3只，用TC-BSA免疫原经腹腔注射免疫小鼠，首次免疫时把免疫原TC-BSA与等量的完全弗氏佐剂充分混匀乳化，免疫剂量100ul/只。以后每间隔2周经腹腔注射加强免疫次，改用不完全弗氏佐剂乳化抗原，免疫剂量与首次相同。从第二次加强免疫起，以后每次免疫后一周断尾取血，分离血清，采用TC-BSA做包被原，采用ELISA间接法和间接竞争进行检测，借以测定抗血清的效价和判定是否有特异性抗体产生，达到合适的效价后，小鼠再加强免疫一次，一周后摘除眼球采血，分离血清，分装后冷冻保存，以备进一步检测使用。

由图3、4可以看出，小鼠的效价随免疫次数的增加而升高，但是免疫一定次数后，效价不再升高，旱稳定不变的趋势，TC-BSA免疫的3只小鼠，经3次加强免疫后，利用TC-OVA做包被原，采用间接ELISA检测结果表明，3只小鼠均有特异性抗体产生采用不同浓度的四环素作竞争抑制物，间接竞争试验证实四环素可特异性地阻断上述反应的发生，证实抗血清中含有针对四环素的特异性抗体。

基于上述，本发明的优点在于，本发明以盐酸四环素和丁胺卡那霉素为主要原料，加入一定量的浓盐酸、玻拍酞亚胺、四环素半抗原，采用碳二亚胺两步合成法制备出对抗生素敏感的抗体，在适当条件下所产生的抗体和药物浓度成比例关系，利用紫外扫描试验以及动物免疫试验证明四环素免疫原的成功合成，同时也证明了包被原的顺利合成，整个原理及操作简单、灵敏度较高，具有优良的生物性能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。