肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用。本发明多克隆分离探针选用的克隆片段分别是RP11-416B14、CTD-2522M13和CTD-2516D6组合，以及CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17组合。本发明克服了现有技术存在的无法常规对肿瘤细胞行细胞培养至有丝分裂期后再进行核型分析的缺陷。本发明利用FISH技术检测Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌特有的基因改变从而诊断该肿瘤，该荧光原位杂交多克隆分离探针应用的准确率高、特异性高、成功率高，荧光信号强，操作简捷，可应用在石蜡切片中，拓展了检测标本的范围，极大地优化了Xp11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的诊断方法。
【专利说明】肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用
【技术领域】
[0001]本发明属于荧光原位杂交探针的应用领域，特别涉及肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用。
【背景技术】
[0002]所谓肾癌是指Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，是2004年WHO新命名的肾癌亚型，以XPl1.2位点上TFE3基因发生断裂易位，并与APSL、PRCC, PSF、NonO, CLTC等相关基因发生融合为特点，引起以TFE3蛋白为主的相关调控蛋白的异常表达。Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌主要好发于青少年，约占儿童肾癌的1/3，成年患者罕见。由于其发病率较低，目前对于Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的认识尚不充分，预后较差，成年患者较儿童预后更差，主要与病理分型、肿瘤分级分期、是否有远处转移等有关。Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性对常规的免疫治疗无效，对放化疗也不敏感，手术是其主要的治疗方式，患者易出现淋巴结和远处转移，只有靶向治疗被证明有一定作用。所以准确诊断对判断患者的预后判断以及术后的辅助治疗至关重要。
[0003]Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌最具特征性的改变，是在Xpll.2位点上TFE3基因发生平衡易位。目前已知有8种不同形式的易位和融合，5种能明确知道基因融合位点的分别是:t(X ；1) (pll.2 ；q21)导致的 PRCC 和 TFE3 基因融合、t (X ；17) (pll.2 ；q25)导致的ASPL和TFE3基因融合、t(X ；1) (pll.2 ；p34)导致的PSF和TFE3基因融合、t(X ；17)(pll.2 ；q23)导致的 CLTC 和 TFE3 基因融合以及 inv(X) (pll ；ql2)导致的 Non0(p54mb)。但不论哪种形式的基因融合，均导致TFE3启动子的改变，从而引起以TFE3蛋白为主的调控蛋白的异常表达。因此，通过免疫组化的方法，对TFE3蛋白的检测是目前诊断Xpl1.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的主要方法。但是免疫组化方法易受到较多因素的影响，可能因为取材不合适或者使用Bouin氏液导致假阴性出现；也可能由于过度抗原回收、抗体浓度过高、过度信号放大等原因出现假阳性结果。另外TFE3蛋白并非只在Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌上特异性表达，在颗粒细胞肿瘤、肾上腺皮质癌、血管周上皮样细胞瘤和高级别粘液纤维肉瘤等肿瘤组织中也会出现TFE3免疫组化的阳性结果。核型分析和RT-PCR检测的方法是确诊XP11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的金标准。但在临床工作中，无法常规对肿瘤细胞行细胞培养至有丝分裂期后再进行核型分析，而RT-PCR从石蜡切片中提取RNA受很多因素制约且技术复杂不适合广泛应用，故目前亟需一种可以快速、经济、准确诊断Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的方法。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对上述诊断方法的缺陷，提供一种肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用。
[0005]本发明的技术方案是:
[0006]肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针，其主要技术特征在于多克隆分离探针选用的克隆片段分别是 RP11-416B14、CTD-2522M13 和 CTD-2516D6 组合，以及 CTD-2312C1、CTD-2248C21 和 RP11-959H17 组合。
[0007]所述多克隆分离探针，其中RP11-416B14、CTD-2522M13和CTD-2516D6组合定位于TFE3端粒侧，三者标记为相同的绿色荧光信号。
[0008]所述多克隆分离探针，其中CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17组合定位于TFE3着丝粒侧，三者标记为相同的红色荧光信号。
[0009]所述位于TFE3端粒侧、TFE3着丝粒侧的克隆片段组合所标记的颜色分别为绿色和红色。
[0010]本发明的另一技术方案是:
[0011]肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针试剂盒，该试剂盒由探针杂交液以及4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚复染剂组成，其主要技术特征在于:[0012](1)TFE3 端粒侧 BAC 克隆片段为 RP11-416B14、CTD-2522M13 和 CTD-2516D6 的组合，标记为绿色荧光；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17的组合，标记为红色荧光；
[0013](2)探针杂交液是由所述多克隆分离探针与Human Cot_lDNA、杂交缓冲液、纯化水按比例混合配置而成，需要-20°C避光冷冻保存；
[0014](3)4'，6-二脒基-2-苯基吲哚复染剂主要用于细胞核DNA染色。
[0015]所述TFE3 端粒侧 BAC 克隆片段为 RP11-416B14、CTD-2522M13 和 CTD-2516D6的组合，标记为绿色荧光；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17的组合，标记为红色荧光，并将上述多克隆分离探针与Human Cot_lDNA、杂交缓冲液、纯化水按比例混合配置成探针杂交液。
[0016]本发明还有一种技术方案是:
[0017]肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针试剂盒应用，其主要技术特征在于在诊断Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌中的应用。
[0018]本发明的优点和效果在于利用FISH技术检测Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌特有的基因改变从而诊断该肿瘤，该荧光原位杂交多克隆分离探针应用的准确率高、特异性高、成功率高，荧光信号强，操作简捷，可应用在石蜡切片中，拓展了检测标本的范围，极大地优化了 Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的诊断方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1——荧光原位杂交多克隆分离探针定位模式示意图。
[0020]图2-女性乳头状肾细胞癌阴性对照病例应用示意图。
[0021]图3-男性乳头状肾细胞癌阴性对照病例应用示意图。
[0022]图4-女性肾透明细胞癌阴性对照病例应用示意图。
[0023]图5-男性肾透明肾细胞癌阴性对照病例应用示意图。
[0024]图6——男性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌应用示意图。
[0025]图7——男性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌应用示意图。
[0026]图8——女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌应用示意图。
[0027]图9——女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌应用示意图。[0028]图10——女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌应用示意图。
[0029]图11——女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌应用示意图。
[0030]图12——女性病例，否定Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌病理诊断示意图。
【具体实施方式】
[0031]本发明的技术思路是:
[0032]荧光原位杂交是利用标记有荧光素的探针特异性地与染色体和(或)基因位点相结合，通过荧光显微镜观察荧光信号的类型，从而检测染色体和相应基因变化的方法，具有安全、快速、经济、灵敏度高、检测信号强、杂交特异性高、能同时显示多种颜色等优点，而且弥补了传统方法对间期细胞、复杂核型细胞以及染色体微缺失无法诊断的缺陷。同时，荧光原位杂交技术可以应用于 石蜡包埋的样本上进行回顾性研究，大大降低了对研究样本的要求。基于近年来荧光原位杂交技术的快速发展，本发明就根据荧光原位杂交的原理，提出了一种用于诊断Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针及其试剂盒应用。
[0033]下面通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0034]本发明采用的多克隆分离探针不同于现有技术及现有探针，是基于对TFE3基因两端特异性的BAC克隆片段结合位点的的综合分析后而筛选出的优化方案。
[0035]本发明中，TFE3端粒侧BAC克隆片段为RP11-416B14(片段长度约为182Kb)、CTD-2522M13 (片段长度约为182Kb)和CTD-2516D6 (片段长度约为218Kb)的组合；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1 (片段长度约为210Kb)、CTD-2248C21 (片段长度约为88Kb)和RP11_959H17(片段长度约为147Kb)的组合。这些片段均为细菌人工染色体克隆(BAC克隆)，其在人类染色体上的定位均已公开。
[0036]TFE3基因与所选的、位于其两侧的(端粒侧和着丝粒侧)BAC克隆片段之间保持一定的距离且不会重叠，而两端BAC克隆片段之间的最短相距仅约36Kb，使得探针在基因未发生易位时两种信号能紧密靠近，不会因为设计原因，使得两个信号间距过大而出现信号分离。TFE3基因两侧各有3个的BAC克隆片段组合，要求同侧相邻的克隆片段之间存在少量的片段重叠，防止同侧克隆片段因间距较大而出现信号断裂，导致单独信号的出现，造成检测结果的误判。
[0037]在X染色体TFE3基因两侧分别标记3个相同颜色的BAC克隆片段是为了增强荧光强度和范围，提高检测的准确性。探针组合中所选用的每一个BAC克隆片段都经过单独测试，最终筛选出信号强度强、特异性好的克隆片段。需要指出的是虽然CTD-2248C21的克隆片段长度只有约88Kb，但是在测试中信号强度较强，同时CTD-2248C21两侧分别连接着CTD-2312C1和RP11-959H17，缺失CTD-2248C21可能会造成着丝粒侧信号的断裂，故其才被选作标记片段之一。
[0038]选择两组共6个克隆片段有以下几点优势:(I)多数克隆片段大小基本都在最适宜的标记长度150-200Kb左右，这样的克隆片段不仅彼此信号强度相似，而且不会出现因为克隆片段长短不一导致信号的强度差异较大；(2)同侧相邻片段之间存在少量序列重叠，使得同种颜色信号相互连续，不会出现同侧信号的断裂以及单独信号的出现，减少误判的几率；⑶两组克隆片段之间最远相距IlOOKb左右，小于1500Kb，使得TFE3基因未发生易位时所标记的两种信号出现融合，这样当阳性组出现信号分离时可与阴性组形成鲜明对t匕。若是间距较远，则无论基因是否易位，都可能出现分离信号，无法实现探针的作用；(4)两组克隆片段之间的最短间距较小，约36Kb，在非易位染色体上出现的是融合信号，不易与分离信号相混淆。
[0039]BAC克隆片段标记荧光，便于使用荧光显微镜观察，方便直观，同时，若需要采用其他检测技术也可以标记成与其对应的检测标记物。
[0040]本发明的作用:
[0041 ] 本发明根据Xp 11.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的基因改变的特点，利用荧光原位杂交 原理，在TFE3基因两侧分别使用不同色荧光标记的多克隆探针，通过检测石蜡包埋组织切片上的融合或者分离信号，判断肿瘤组织基因是否发生特定的基因易位，提高了诊断准确率，为判断患者预后和术后辅助治疗提供准确的信息和指导。根据我们的实验结果，该探针应用的准确率高、特异性高、成功率高，实验信号强，操作简单快捷，尤其是可在石蜡切片中应用，拓展了检测标本的范围，为准确诊断Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌提供了新的工具。
[0042]实施例1:
[0043]步骤1:多克隆DNA探针的制备:
[0044]通过http://genome, ucsc.edu/查找X染色体TFE3基因两侧(即端粒侧和着丝粒侧)对应的细菌人工染色体(BAC克隆)，两侧分别选择3个大小相近的BAC克隆片段，控制两侧BAC克隆片段之间的最远距离在1500Kb以内且互不重叠，而同侧3个片段相互之间有一定序列的重叠。按上述要求选取TFE3端粒侧BAC克隆片段为CTD-2516D6 (chrX:48265836-48484403，片段长度约为 218Kb)、CTD-2522M13 (chrX:48420425-48602847,片段长度约为 182Kb)、RPll-416B14(chrX:48580872-48763198,片段长度约为 182Kb) ；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1 (chrX:48959513-49170367,片段长度约为210Kb)、CTD-2248C21(chrX:49154756-49242991,片段长度约为 88Kb)、RPl1-959H17(chrX:49293025-49440119,片段长度约为 147Kb)。并在 http://projects.tcag.ca/cg1-bin/efish/i ndex.cgi对所选取的BAC克隆进行特异性分析，明确所选BAC片段在X染色体上的特异性。本发明中的荧光原位杂交多克隆分离探针定位模式如图1所示。从Invitrogen公司购置相应的BAC克隆，将BAC克隆培养后提取质粒，利用缺口平移法，将端粒侧的3个BAC克隆片段用Sptectrum green-dUTP标记为绿色荧光，将着丝粒侧3个BAC克隆片段用Sptectrum orange-dUTP标记为红色突光,两端颜色可以互换。并将标记好的探针与HumanCot-1DNA、杂交缓冲液、纯化水按比例配置成探针杂交液，-20°C避光冷冻保存。
[0045]下一步，将制备的探针采用荧光原位杂交的方法，在已临床诊断的Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌和非Xpll.2基因易位性肾癌组织中验证其诊断效果。
[0046]步骤2:荧光原位杂交过程:
[0047]将3um肿瘤组织切片置于65±1°C恒温箱烤片过夜。取出后放入二甲苯浸泡30min，再放入无水乙醇浸泡lOmin。接着放入100%、85%、70%梯度乙醇和纯化水中复水各3min，再放入纯化水中100±5°C煮片20min。取出晾干后，在样本区域滴加IOOul胃蛋白酶反应液，消化5min。迅速放入2 X SSC洗涤5min，最后放入室温70 %、85 %、100 %梯度乙醇依次脱水各3min，取出晾干。加10 μ I的杂交液至干燥22 X 22mm盖玻片上，将样本片翻转，使样本朝下，迅速盖上，反转后轻压盖玻片使杂交液均匀分布；用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；将玻片放在85土 1°C的热台上，变性5min ;迅速将玻片放入预热的杂交盒中，避光，37土 TC孵育过夜。将2xSSC溶液、0.1 % NP-40/2xSSC溶液放入37土 1°C的水浴中预热；去除橡皮胶水和盖玻片，将玻片放入2xSSC溶液中洗涤IOmin ;再转入0.1% NP-40/2xSSC溶液中洗涤5mi η ;然后室温70%乙醇脱水3min。取出玻片在暗处晾干后，滴加10μ I DAPI复染剂至干燥的22X22mm盖玻片上，反转样本片，使盖玻片载玻片的目标区域接触，反转后轻压，避免产生气泡，在暗处存放，待观察。
[0048]结果判定:
[0049]参照通行的双色探针使用标准，在暗室中用Olympus BX51荧光显微镜DAPI/FIFC/TexasRed三色滤光镜激发，100倍物镜下观察间期细胞，判别荧光信号；用Imstar公司提供的免疫荧光软件分析图像，评估整个切片的探针杂交情况。每一例切片的整个核心区域至少有100个互不重叠的细胞核，并观察到明确的荧光信号，才能确定免疫荧光原位杂交检测有效。[0050]使用荧光显微镜可以观察到两种信号类型:(I)融合信号:在未发生TFE3基因易位的肿瘤组织中，由于双色信号相距较近而出现的黄色信号(红绿双色叠加的效果)或者红绿连续信号。融合信号的数量取决于细胞核内X染色体数目，正常女性出现2个融合信号，而男性只出现I个融合信号；(2)分离信号:当发生TFE3基因平衡易位时，TFE3基因端粒侧易位至其它染色体，而易位后X染色体仅保留原TFE3着丝粒侧基因，导致分别标记在TFE3基因两端的红绿信号出现分离。只有当红绿信号分离同时出现且距离一个信号直径以上时，才能记为分离信号。女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌患者可出现I个融合信号和I对分离信号，而男性患者只会出现I对分离信号。
[0051]每一例切片的整个核心区域至少有100个互不重叠的细胞核，在核心区域有超过10%的肿瘤细胞核出现红绿分离信号，判断荧光原位杂交阳性；未出现红绿分离信号，则判断荧光原位杂交阴性；单独出现红色或绿色信号则不计数。
[0052]结果:
[0053]我们对30例肾脏肿瘤标本利用本多克隆分离探针进行检测，其中10例临床诊断为Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌、10例乳头状肾细胞瘤、10例肾透明细胞癌。如果患者病理切片出现分离信号并达到荧光原位杂交诊断阳性标准，即可确诊Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌。10例Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌中，9例符合荧光原位杂交诊断标准，判断为阳性，I例阴性；乳头状肾细胞瘤和肾透明细胞癌组织切片均未检测出分离信号，判断为阴性。图2为女性乳头状肾细胞癌阴性对照病例，在肿瘤组织细胞核内见2个红绿融合信号，代表2条未发生易位的X染色体；图3为男性乳头状肾细胞癌阴性对照病例，在肿瘤组织细胞核内见I个红绿融合信号，代表1条未发生易位的X染色体；图4为女性肾透明细胞癌阴性对照病例，在肿瘤组织细胞核内见2个红绿融合信号，代表2条未发生易位的X染色体；图5为男性肾透明肾细胞癌阴性对照病例，在肿瘤组织细胞核内见I个红绿融合信号，代表1条未发生易位的X染色体；图6为男性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，在肿瘤组织细胞核内见I对红绿分离信号，代表发生易位的X染色体；图7为男性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，在肿瘤组织细胞核内见I对红绿分离信号，代表发生易位的X染色体；图8为女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，在肿瘤组织细胞核内见I对红绿分离信号和I个融合信号，分别代表1条发生易位的X染色体和I条未发生易位的X染色体；图9为女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，在肿瘤组织细胞核内见I对红绿分离信号和I个融合信号，分别代表1条发生易位的X染色体和I条未发生易位的X染色体；图10为女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，在肿瘤组织细胞核内见I对红绿分离信号和I个融合信号，分别代表1条发生易位的X染色体和I条未发生易位的X染色体；图11为女性Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，在肿瘤组织细胞核内见I对红绿分离信号和一个融合信号，分别代表1条发生易位的X染色体和I条未发生易位的X染色体；图12为女性病例，临床病理和免疫组化诊断为Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌诊断示意图，但本荧光原位杂交多克隆分离探针检测阴性，在肿瘤组织细胞核内见2对红绿融合信号，代表2条未发生易位的X染色体，由此否定病理和免疫组化诊断。
[0054]评价:
[0055]本探针所采用的两组6个克隆片段尚未有相同探针使用，且克隆片段大小相对一致。每一种克隆片段标记信号强度较相似，同侧标记的探针信号不出现间断，信号强度较一般探针强，特异性高，充分考虑到应用于诊断试剂以及制备成诊断试剂盒时的探针的可靠性和有效性，符合应用于临床诊断的要求。利用荧光原位杂交技术，使用TFE3基因双色分离荧光原位杂交多克隆探针诊断Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌准确、快速、经济且成功率高，极大的优化了 Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的诊断方法。从附图2-5中可以看出利用该探 针检测所有的乳头状肾细胞瘤以及肾透明细胞癌均是阴性，而在附图6-11中显示该探针检测Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌的肿瘤组织切片中多数细胞核中均能显示荧光信号，且荧光信号清晰，信号亮度高，且在每一例组织切片中均成功进行FISH检测。实验结果显示本发明在特异性强及敏感性高的优势，同时该探针穿透性强，信号清晰，信号亮度高符合制备成诊断试剂盒的要求。
[0056]实施例2 =Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌诊断试剂盒
[0057]肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针试剂盒，该试剂盒由探针杂交液以及4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚复染剂组成，其特征在于:
[0058](1)TFE3 端粒侧 BAC 克隆片段为 RP11-416B14、CTD-2522M13 和 CTD-2516D6 的组合，标记为绿色荧光；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17的组合，标记为红色荧光。
[0059](2)将两种多克隆分离探针与与Human Cot_lDNA、杂交缓冲液、纯化水按比例混合配置成探针杂交液，_20°C避光冷冻保存。
[0060](3)4'，6-二脒基-2-苯基吲哚复染剂主要用于细胞核DNA染色。
[0061]该肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针试剂盒主要用于诊断Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌，其特征在于:TFE3端粒侧BAC克隆片段为RP11-416B14、CTD-2522M13和CTD-2516D6的组合，标记为绿色荧光；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17的组合，标记为红色荧光，并将上述多克隆分离探针与HumanCot-1DNA、杂交缓冲液、纯化水按比例混合配置成探针杂交液。
[0062]本发明所述的检测试剂盒使用方法如下:[0063]1.将包含肿瘤组织的样本经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋后制备成3um组织切片；
[0064]2.将切片置于65±1°C恒温箱烤片过夜，取出后放入二甲苯浸泡30min，再放入无水乙醇浸泡lOmin。接着放入100%、85%、70%梯度乙醇和纯化水中复水各3min，再放入纯化水中100 ±5 °C煮片20min ；
[0065]3.取出晾干后，在样本区域滴加IOOul胃蛋白酶反应液，消化5min，迅速放入2 X SSC洗涤5min，最后放入室温70%、85%、100%梯度乙醇依次脱水各3min，取出晾干；
[0066]4.加10 μ I本发明的探针杂交液至干燥22X 22mm盖玻片上，将样本片翻转，使样本朝下，迅速盖上，反转后轻压盖玻片使杂交液均匀分布，用橡皮胶水沿盖玻片边缘封片，完全覆盖盖玻片与载玻片接触的边缘；
[0067]5.将玻片放在85±1°C的热台上，变性5min，迅速将玻片放入预热的杂交盒中，避光，37± I°C孵育过夜；
[0068]6.将2xSSC溶液、0.1 % NP_40/2xSSC溶液放入37± I °C的水浴中进行预热，去除切片上的橡皮胶水和盖玻片，将玻片放入2xSSC溶液中洗涤lOmin，再转入0.1%NP-40/2xSSC溶液中洗涤5min ;然后室温70%乙醇脱水3min ；
[0069]7.取出玻片 在暗处晾干后，滴加10 μ I DAPI复染剂至干燥的22X 22mm盖玻片上，反转样本片，使盖玻片载玻片的目标区域接触，反转后轻压，避免产生气泡，在暗处存放，使用荧光显微镜观察荧光信号。在非Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌患者，红绿信号融合显示黄色信号，即阴性结果；在Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌患者的组织切片中，因X染色体TFE3基因发生断裂易位使得红绿信号发生分离，判断为阳性结果，从而明确诊断。
【权利要求】
1.肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针，其特征在于多克隆分离探针选用的克隆片段分别是 RP11-416B14、CTD-2522M13 和 CTD-2516D6 组合，以及 CTD-2312C1、CTD-2248C21 和RP11-959H17 组合。
2.根据权利要求1所述的肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针，其特征在于其中RP11-416B14、CTD-2522M13和CTD-2516D6组合定位于TFE3端粒侧，三者标记为相同的绿色荧光信号。
3.根据权利要求1所述的肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针，其特征在于其中CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17组合定位于TFE3着丝粒侧，三者标记为相同的红色突光信号。
4.根据权利要求2、3所述的肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针，其特征在于位于TFE3端粒侧、TFE3着丝粒侧的克隆片段组合所标记颜色分别标记为绿色和红色。
5.肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针试剂盒，该试剂盒由探针杂交液以及4'，6- 二脒基-2-苯基吲哚复染剂组成，其特征在于: (1)TFE3端粒侧 BAC 克隆片段为 RP11-416B14、CTD-2522M13 和 CTD-2516D6 的组合，标记为绿色荧光；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17的组合，标记为红色荧光； (2)探针杂交液是由所述多克隆分离探针与HumanCot_lDNA、杂交缓冲液、纯化水按比例混合配置而成，需要_20°C避光冷冻保存； (3)4',6- 二脒基-2-苯基吲哚复染剂主要用于细胞核DNA染色。
6.一种如权利要求5所述的肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针试剂盒，其特征在于:TFE3端粒侧BAC克隆片段为RP11-416B14、CTD-2522M13和CTD-2516D6的组合，标记为绿色荧光；TFE3着丝粒侧BAC克隆片段为CTD-2312C1、CTD-2248C21和RP11-959H17的组合，标记为红色荧光，并且将上述多克隆分离探针与Human Cot_lDNA、杂交缓冲液、纯化水按比例混合配置成探针杂交液。
7.—种如权利要求5所述的肾癌的荧光原位杂交多克隆分离探针试剂盒应用，其特征在于在诊断Xpll.2易位/TFE3基因融合相关性肾癌中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103952493SQ201410216034
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年5月20日 优先权日:2014年5月20日
【发明者】甘卫东, 陈显成, 叶庆, 陈绍宇, 郭宏骞, 李冬梅 申请人:南京大学医学院附属鼓楼医院