红核妇洁洗液一测多评指纹图谱的检测方法与流程

本发明涉及属于中成药化学分析检测领域，尤其涉及红核妇洁洗液一测多评指纹图谱的检测方法。

背景技术：

红核妇洁洗液是山东步长神州制药有限公司的妇科外用产品，该药的国药准字号为z10980131，现今执行的国家药品标准编号为ws3－056(z-010)-2001(z)，其有效成分由山楂核一味中药材为原料，经干馏等现代制备工艺精制而成，该药中含酚类、醛类、酮类、有机酸类等多种有效活性成份，具有解毒祛湿，杀虫止痒的功效。用于湿毒下注之阴痒、带下；霉菌性阴道炎和非特异性阴道炎见上述证候者。其在治疗阴道炎方面具有突出的疗效，该产品之前已经申请多件发明专利申请：其专利申请号为03139655.0、201210071276.x、201210070908.0、201210070797.3、201410348891.x，上述专利保护内容主要集中在洗液、栓剂以及相关临床新用途方面。但由于红核妇洁洗液有良好的临床效果且市场销售前景广阔，而目前质量标准目前检测红核妇洁洗液质量的方法中愈创木酚的薄层鉴别(tlc)及糠醛、愈创木酚的gc含量测定。存在如下技术问题和缺陷：①、含量测定项的检测指标采用糠醛、愈创木酚两种成分，难以全面检测红核妇洁洗液的质量；②、红核妇洁洗液质量检测中采用的薄层鉴别方法(tlc)操作复杂、检验周期长，使用的化学有机试剂危害检验人员的职业健康。

为了保证中药制剂的安全性与有效性，中药制剂质量检测的方法与手段成为中药现代化的最重要研究之一。按照传统中医药学的“整体观”，中药药效是药品中多个药效成分的综合效应的结果，而中药制剂的多中心多靶点特点使得单一成分或指标难以表达中药的质量，采用中药指纹图谱这种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。因此，迫切需要一种全面、高效、安全的质量检测方法能同时定性和定量测定及检测红核妇洁洗液的质量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供红核妇洁洗液一测多评指纹图谱的检测方法，该检测方法采用气相指纹图谱测定红核妇洁洗液中的糠醛、愈创木酚、5-甲基愈创木酚、4-甲基愈创木酚、3-甲氧基邻苯二酚、4-乙基愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚等13种有效成分，克服现有技术中薄层色谱法和单一成分检测方法。采用的13种成分为参照标准的全谱峰匹配指纹图谱技术可起到全面检测红核妇洁洗液质量及稳定性的作用，以保证其红核妇洁洗液的内在质量。

本发明提供的技术方案如下：红核妇洁洗液一测多评指纹图谱的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

⑴、供试品溶液的制备：取本品适量，混匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得；

⑵、对照品标准液的制备：取愈创木酚对照品适量，精密称定，加乙醇制成每1ml含0.13～0.18mg/ml的溶液，即得；

⑶、色谱条件与系统适用性试验：以石英毛细管柱为色谱柱；流速0.8～1.4ml/min；柱温为程序升温：初始温度55～65℃，以每分钟2～4℃的升温速率升温至85～95℃，保持2～5分钟，再以每分钟8～12℃的升温速率升温至110～130℃，保持6～10分钟，以每分钟4～6℃的升温速率升温至170～190℃，保持7～13分钟，再以每分钟30～50℃的升温速率升温至290～310℃，保持10～14分钟；进样口温度270～290℃；检测器温度290～310℃；分流进样，分流比8～12：1；

⑷、色谱峰测定：将上述步骤⑴和⑵所制得的供试品和对照品溶液，注入气相色谱仪，按照上述步骤⑶的色谱条件，测定供试液溶液，记录6～48分钟的色谱图，即得，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

作为本发明的优选，所述步骤⑵对照品溶液制备方法中，愈创木酚储备液浓度为0.15mg/ml。

作为本发明的进一步优选，所述步骤⑶色谱条件与系统适用性试验中，流速1.1ml/min；柱温为程序升温：初始温度60℃，以每分钟3℃的升温速率升温至90℃，保持4分钟，再以每分钟10℃的升温速率升温至120℃，保持8分钟，以每分钟5℃的升温速率升温至180℃，保持11分钟，再以每分钟40℃的升温速率升温至300℃，保持12分钟；进样口温度280℃；检测器温度300℃。

作为本发明的优选，所述步骤⑶色谱条件与系统适用性试验中，分流进样，分流比：10：1。

作为本发明的进一步优选，所述⑶色谱条件中，所述石英毛细管柱的固定相为5％苯基甲基聚硅氧烷，色谱柱型号为db-5。

为了突出本发明技术方案创新性，我们将本实验过程中筛选的部分实验提供如下。

①、色谱柱优化：选择合适色谱柱能使红核妇洁洗液中有效成分中更好实现分离，我们考察非极性色谱柱hp-1、弱极性色谱柱db-5、中等极性色谱柱db-624、强极性色谱柱db-wax、改性强极性色谱柱hp-ffap等不同极性和型号的色谱柱，进行大量的实验。由于山楂核干馏液包括酚类、醛类、酮类以及酯类等多种物质，成分复杂，极性差异较大，故分别选择非极性、弱极性、中等极性以及强极性色谱柱进行试验，结果以(5％苯基)甲基聚硅氧烷为固定液的弱极性色谱柱效果最理想。

②、提取溶剂的考察

愈创木酚与乙醇可以混溶，现行质量标准中，愈创木酚和糠醛的含量测定均以无水乙醇作为提取溶剂，分别以乙醇和无水乙醇作为溶剂进行考察。供试品溶液的制备：取本品(批号：171036)适量，混匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，分别加乙醇、无水乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，测定，计算含量。结果见表1。

表1提取溶剂考察结果

由测定结果可知，乙醇和无水乙醇基本无差异，但是乙醇更为常用，因此确定以乙

醇作为提取溶剂。

③、溶剂量的考察

供试品溶液的制备：取本品(批号：171036)适量，混匀，精密量取1ml，分别置5ml、10ml、25ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，测定，计算含量。结果见表2。

表2溶剂量考察结果

由测定结果可知，不同溶剂量对测定结果影响较小，综合考虑溶剂量以及色谱响应值，确定料液比为1:10。

④、供试品溶液制备方法的确定

经试验，加入乙醇振摇后，红核妇洁洗液即变为澄清液体，故未对提取方法进行考察，综合提取溶剂和溶剂量的考察结果，供试品溶液的制备如下：取本品适量，混匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

⑤、指纹图谱的建立

取收集的20批红核妇洁洗液样品，按照前文确定的供试品溶液的制备方法及色谱条件，进行测定，记录色谱图。将20批样品的gc图谱以aia格式依次导入国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件，采用多点校正，全谱峰匹配，获取共有模式作为对照指纹图谱，以共有的13个主要色谱峰作为mark峰。对照指纹图谱的生成及对照指纹图谱见附图1～2。

⑥、共有峰的指认

采用thermoqexactivegc高分辨质谱仪结合对照品对共有峰进行指认，确认3号峰为糠醛，6号峰为愈创木酚，7号峰为5-甲基愈创木酚，8号峰为4-甲基愈创木酚，9号峰为3-甲氧基邻苯二酚，10号峰为4-乙基愈创木酚，11号峰为2,6-二甲氧基苯酚，12号峰为2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚。对照品定位及质谱信息见图3～17。

本发明具有以下有益效果：

⑴、目前对检测红核妇洁洗液质量的方法中仅对愈创木酚的薄层鉴别(tlc)及糠醛、愈创木酚的gc含量测定。针对现有的含量测定糠醛、愈创木酚两种成分，难以全面检测红核妇洁洗液的质量。本发明结合气相色谱指纹图谱分析方法，采用一测多评法同时鉴定，并对红核妇洁洗液中的糠醛、愈创木酚、5-甲基愈创木酚、4-甲基愈创木酚、3-甲氧基邻苯二酚、4-乙基愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚等13种有效成分，本发明所建立的上述检测成分现代药理实验表明，其具有抑菌及杀菌活性的活性，与该药品的解毒祛湿，杀虫止痒的功效相吻合，可以比较科学合理的作为其检测的指标成分。本发明采用全谱峰匹配指纹图谱技术，生成红核妇洁洗液对照指纹图谱，以保证其质量的稳定性、均一性、可控性。可以起到全面检测红核妇洁洗液内在质量的作用。

⑵、现有技术中红核妇洁洗液质量检测中采用的薄层鉴别方法(tlc)操作复杂、检验周期长，使用的化学有机试剂危害检验人员的职业健康，本发明提高了红核妇洁洗液的质量检测水平，去掉了耗时较长(2小时)及使用有机有害试剂(环己烷、醋酸乙酯、盐酸)缩短了检验周期，提高了工作效率，降低了检验成本、同时减少了有机、有害试剂的使用，防止了有机、有害试剂对工作人员的身体健康损害。

⑶、本发明建立上述成分的含量检测方法，其测定结果显示，保留时间精密度(rsd≤1.90％)、峰面积精密度(rsd≤0.6％)、保留时间重复性(rsd≤0.03％)、峰面积重复性(rsd≤1.87％)、保留时间稳定性(rsd≤0.06％)、峰面积稳定性(rsd≤1.90％)，由此可见，其检测方法具有良好稳定操作性等优点，对本公司收集的20批红核妇洁洗液样品的相似度测定结果均大于0.99，表明其指纹图谱检测方法的可靠性，可以作为红核妇洁洗液内在质量检测标准。

综上所述，本发明检测方法全面、高效、安全良好的特点，在工艺化大生产应用中有广阔的前景。

附图说明

图1-20批红核妇洁洗液样品对照指纹生成图谱；

图2-红核妇洁洗液对照指纹图谱(图中标记*色谱峰，因部分批次样品缺失，故未列入共有峰)。其中上述图谱中3号峰为糠醛，6号峰为愈创木酚，7号峰为5-甲基愈创木酚，8号峰为4-甲基愈创木酚，9号峰为3-甲氧基邻苯二酚，10号峰为4-乙基愈创木酚，11号峰为2,6-二甲氧基苯酚，12号峰为2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚；

图3-红核妇洁洗液gc色谱图；

图4-糠醛对照品gc色谱图；

图5-愈创木酚对照品gc色谱图；

图6-5-甲基愈创木酚高分辨质谱图；

图7-5-甲基愈创木酚对照品gc色谱图；

图8-4-甲基愈创木酚高分辨质谱图；

图9-4-甲基愈创木酚对照品gc色谱图；

图10-3-甲氧基邻苯二酚高分辨质谱图；

图11-3-甲氧基邻苯二酚对照品gc色谱图；

图12-4-乙基愈创木酚高分辨质谱图；

图13-4-乙基愈创木酚对照品gc色谱图；

图14-2,6-二甲氧基苯酚高分辨质谱图；

图15-2,6-二甲氧基苯酚对照品gc色谱图；

图16-2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚高分辨质谱图；

图17-2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚对照品gc色谱图。

具体实施方式

为了更加充分理解本发明的实施，下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。除非另作定义，本发明专利申请说明书以及权利要求书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

实施例1：

1仪器与试药

1.1仪器

本实验采用的仪器有：agilent7890a气相色谱仪；sartoriuscp225d电子天平。

1.2试药

本实验采用的标准对照品物质及来源：具体信息见表3。

表3标准物质具体信息

试剂：乙醇、无水乙醇为分析纯

1.3方法与结果

1.3.1色谱条件与系统适用性试验：

综合考虑分离效果及载样量，以db-5(30m×0.32mm×1.5μm)进行试验。流速1.1ml/min；柱温为程序升温：初始温度60℃，以每分钟3℃的升温速率升温至90℃，保持4分钟，再以每分钟10℃的升温速率升温至120℃，保持8分钟，以每分钟5℃的升温速率升温至180℃，保持11分钟，再以每分钟40℃的升温速率升温至300℃，保持12分钟；进样口温度280℃；检测器温度300℃；分流进样，分流比10:1。理论板数按愈创木酚峰计算应不低于100000。

1.3.2参照物溶液的制备

查阅文献，愈创木酚等酚类成分为山楂核干馏液的主要药效成分，故以愈创木酚作为参照物进行试验。并以该成分作为评价指标对供试品溶液的制备方法进行考察。

参照物溶液的制备：精密称取愈创木酚对照品15.18mg，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为1.5134mg/ml的愈创木酚参照物储备液；再精密量取1ml，置10ml量瓶中，用乙醇稀释至刻度，摇匀，得到浓度为0.1513mg/ml的愈创木酚参照物溶液。

1.3.3供试品溶液的制备

供试品溶液的制备：取红核妇洁洗液样品(批号：171036)适量，混匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，测定，计算含量。

1.4方法学考察

1.4.1精密度试验

供试品溶液的制备：取红核妇洁洗液样品(批号：171036)适量，混匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。取上述供试品溶液，注入气相色谱仪，每次1μl，连续进样6次，记录色谱图，并使用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件对其相似度进行计算，结果见表4～6。

表4保留时间精密度结果

表5峰面积精密度结果

表6相似度精密度结果

试验结果表明，仪器精密度良好。

1.4.2重复性试验

供试品溶液的制备：取红核妇洁洗液样品(批号：171036)适量，混匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。平行制备6份供试品溶液，注入气相色谱仪，每次1μl，记录色谱图，并使用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件对其相似度进行计算，结果见表7～9。

表7保留时间重复性结果

表8峰面积重复性结果

表9相似度重复性结果

试验结果表明，该方法重复性良好。

1.4.3稳定性试验

供试品溶液的制备：取红核妇洁洗液样品(批号：171036)适量，混匀，精密量取1ml，置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。取上述供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24小时注入气相色谱仪，每次1μl，记录色谱图，并使用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)软件对其相似度进行计算，结果见表10～12。

表10保留时间稳定性实验结果

表11峰面积稳定性实验结果

表12相似度稳定性结果

试验结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性良好，能够满足测定需要。

1.4.4样品的测定

取山东步长制药神州制药生产的红核妇洁洗液，其批号为：170901、170902、171105、171106、171107、171109、171110、180307、180308、180309、160520、160521、170903、171024、171021、171033、171036、171039、180201、180202，适量，混匀，精密量取1ml，分别置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液各1μl，注入气相色谱仪，测定，计算含量。对收集的20批样品进行色谱测定，结果见表13。

表13样品测定结果

收集的20批样品的相似度测定结果差异不大，均大于0.99。本品为独家生产品种，且为单方制剂，故参考《中国药典》2015年版一部植物油脂和提取物的相似度限值，暂定相似度限度值为不得低于0.90。

最后应说明的是：本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，但凡在本发明的精神和实质范围内，所作的任何改变、等同替换和改进，均在本发明的保护范围之内。