用于准确测定人血清中多种抗癫痫药物血药浓度的试剂盒及检测方法与流程

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及用于准确测定人血清中多种抗癫痫药物血药浓度的试剂盒及检测方法。

背景技术：

苯巴比妥(phenobarbital，pb)、苯妥英(phenytoin，pht)、卡马西平(carbamazepine，cbz)、奥卡西平(oxcarbazepine，oxc)和拉莫三嗪(lamotrigine，ltg)这几种抗癫痫药物均属控制状类药物，绝大多数癫痫患者需长期用药且对药物反应具极大的个体差异性。pb、pht和cbz都是临床常用的一线抗癫痫药物，oxc和ltg则是近十年上市的第二代抗癫痫药物，由于各药的药理特点及临床指症不同，临床常联合用药。

但其治疗浓度范围很窄，代谢的个体差异大，中毒浓度与治疗浓度范围接近，具有自身诱导作用，体内处置过程复杂，存在浓度和效应的较大个体差异。抗癫痫作用和毒性作用与血药浓度密切相关，长期服用不良反应较多，并易产生耐药性。另外，虽然临床上治疗癫痫多主张单一用药，但有相当一部分患者属难治性癫痫，需要联合用药，或是传统抗癫痫药的联合应用，如卡马西平、苯巴比妥、苯妥英钠、丙戊酸间的联合应用，或是传统抗癫痫药与新抗癫痫药的联合应用，如ltg与目前常用的抗癫痫药如pht、cbz等在药动学上存在相互作用，尤其是传统的抗癫痫药多为肝药酶诱导剂或抑制剂，对与其联用的药物均有影响。可见多药联用药物间的相互作用使得抗癫痫药的药动学行为更为复杂，导致患者个体间血药浓度差异较大，临床使用时也需要进行血药浓度的监测和个体化给药。pb对肝药酶诱导作用而影响其它药物的正常代谢，导致血药浓度降低；cbz在治疗血药浓度范围内出现副作用，自身诱导代谢使得血药浓度和清除发生较大变化；pht还具有非线性动力学特征，临床均主张个体化给药。oxc与pht、pb、ltg合用时，可提高pht的血药浓度，降低其代谢，使后者毒性增加，表现为共济失调，眼球震颤，反射亢进等，也可使肝脏对ltg的代谢增加，使之血药浓度降低，抗癫痫作用减弱。因此，患者需规范地服药治疗。为了提高临床用药的有效性和安全性，减少或避免毒副反应，并为用药过量的中毒诊断和处理提供可靠的客观依据，因此需要进行血药浓度的监测和个体化给药。

目前，国内外测定血清抗癫痫药浓度的方法很多，常用监测方法有荧光偏振免疫法(fpia)及酶增强免疫法(emit)、高效液相色谱(hplc)及液-质联用技术(lc-ms/ms)等方法。免疫法操作简单，但试剂需依赖进口，价格昂贵，效期短，不能多种药物同时测定，对于病源不多的基层医院，成本相对较高，不利于基层医院开展。其中fpia法利用抗原抗体相互识别结合产生检测信号，当某些抗原具有与待测物相同的抗原表面标志或抗体有多个抗原结合位点时，可导致抗体与抗原结构相近的母体代谢产物、内源性物质产生交叉反应，使测定结果高于专一性更强的hplc法。利用fpia法测定cbz时，cbz于人体内代谢为10,11-环氧卡马西平(cbze)，其药理作用和毒副作用与cbz相似，fpia法测定值为cbze与cbz之和，用fpia法无法排除代谢产物对其干扰。hplc法和lc-ms/ms法特异性强，灵敏度高，通过调整合适的色谱条件其代谢产物不会干扰到分析物的测定，并可同时测定多种药物及其代谢产物，结果准确，且线性范围相对较宽，能够满足临床病人的检测，而lc-ms/ms相较于hplc，其仪器价格和维护成本也相应较高，对人员和环境的要求也更高，所花时间和成本不菲，对于临床使用来讲还有不少距离。

目前，液相临床检验方法均为实验室自行建立的方法，存在前处理操作较复杂，分析时间较长，所需有机溶剂多，灵敏度低等问题，且采用的试剂多为非试剂盒产品，因此，迫切需要商品化的液相检测试剂盒。

技术实现要素：

本发明针对上述现有技术的不足，提供一种无需进行复杂的净化提纯步骤，而且所需分析时间少；提高了检测的速度；采用梯度洗脱方式，更能保护色谱柱的效能，可与液相色谱仪配套使用，适用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测血清中苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物的浓度，达到单样本多指标同步检测功能，具有准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉等特点的用于准确测定人血清中多种抗癫痫药物血药浓度的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种用于准确测定人血清中多种抗癫痫药物血药浓度的试剂盒，该试剂盒主要包括：

(1)校准品母液：使用甲醇或乙腈为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：

拉莫三嗪：10.00μg/ml、20.00μg/ml、50.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml；

苯巴比妥：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

奥卡西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

卡马西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

苯妥英：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

上述校准品母液均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×40/200；

(2)内标：内标溶液为酮洛芬的甲醇溶液(酮洛芬为溶质，甲醇为溶剂，配置成的溶液)，酮洛芬在溶液中的浓度范围为10-1000μg/ml；

(3)质控品：包括质控品1和质控品2，其中

质控品1的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：3.95-5.93μg/ml；苯巴比妥：8.76-11.80μg/ml；奥卡西平：5.59-9.32μg/ml；卡马西平：3.86-5.78μg/ml；苯妥英：4.22-5.72μg/ml；

质控品2的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：11.40-17.00μg/ml；苯巴比妥：38.00-57.00μg/ml；奥卡西平：15.80-23.70μg/ml；卡马西平：11.70-17.60μg/ml；苯妥英：23.10-31.30μg/ml；

质控品1和质控品2均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合物构成；各个成分的浓度为在质控品1或质控品2的混合物中的各自浓度；

(4)基质校正液：基质校正液为空白血清冻干粉；

(5)萃取液：萃取液为叔丁基甲基醚溶液(即100％的叔丁基甲基醚)；

(6)复溶液：复溶液为甲醇或乙腈与水组成的混合物，混合物中甲醇或乙腈的体积百分比含量为40-100％；

(7)流动相：流动相a为水溶液，流动相b为乙腈溶液，二者均含有体积百分比含量为0.05-0.2％的甲酸。

优选的，本发明上述步骤(1)中稀释液(溶剂)为甲醇溶液。

优选的，本发明上述步骤(3)中的质控品1和质控品2均由拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合物构成，质控品1或者质控品2的形式可以为冻干粉、血清基质或甲醇溶液基质。

优选的，本发明上述步骤(6)复溶液的体积百分比含量为50％的甲醇水溶液。

优选的，本发明上述步骤(7)流动相a中甲酸的体积百分比含量为0.1％，流动相b中甲酸的体积百分比含量为0.05％。

本发明上述试剂盒中还包括操作说明书。

本发明还提供一种用于准确测定人血清中抗癫痫药物血药浓度的试剂盒的检测方法，包括：向人血清中加入内标酮洛芬的甲醇溶液，混合，然后加入萃取液，混合离心，移取上清液氮气吹干后加入复溶液复溶，混合离心，取上清液使用液相色谱仪-pda检测器进行检测，采用内标标准曲线法进行定量。

本发明用于准确测定人血清中抗癫痫药物血药浓度的试剂盒的检测方法，其具体的方法步骤为：

(1)检测样本处理

(1.1)校准品：在室温下，准确吸取40μl校准品母液于离心管中，45℃氮气吹干后加入200μl基质校正液，漩涡混合后，再加入100μl含有已知浓度的内标，漩涡混合1min后加入800μl萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，15000r/min离心2min，取上清液45℃氮气吹干；再加入150μl复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清120μl加入到进样瓶中用于色谱分析；

(1.2)质控品/血清样本：在室温下，准确吸取200μl质控品/血清样本于离心管中，再加入100μl含有已知浓度的内标，漩涡混合1min后加入800μl萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，15000r/min离心2min，取上清液45℃氮气吹干；再加入150μl复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清120μl加入到进样瓶中用于色谱分析；

(2)样本检测分析

(2.1)色谱条件

·色谱柱：c18柱或者相当；

·流动相：流动相a和流动相b；

·检测波长：拉莫三嗪(265nm)；苯巴比妥和苯妥英(230nm)；奥卡西平(240nm)；

卡马西平(284nm)；

·流速：0.5ml/min；

·梯度洗脱：按下表1所示；

表1

上表中的梯度洗脱过程，流动相中流动相a和流动相b体积比例随时间不断调整变化，以流动相b的占比变化为体现。

·柱温：40℃；

·进样器温度：8℃；

·进样量：8μl；

(2.2)取处理好的校准品、质控品和样本各8μl注入液相色谱仪，记录色谱图；

(2.3)检测结果的计算

(2.3.1)校准曲线的绘制与拟合：一般液相色谱分析软件可根据校准结果自动绘制校准曲线，以6个校准品工作液与内标的浓度比为横坐标(x)，以6个校准品工作液的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，用最小二乘法进行线性回归，自动绘制标准曲线，可获得回归方程：y＝ax+b，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为斜率，b为截距，并计算r(相关系数)值，r值≥0.9900；

(2.3.2)回收率的计算：质控品各分析物的测定浓度可根据质控品中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得，其回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在85％-115％范围内；

(2.3.3)样本结果的计算：样本中的各分析物测定浓度可根据样本中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得。

本发明上述步骤(1)中漩涡混合转速为2000rpm，在该转速下，以确保混合液完全混匀，并使待测物质完全提取出来。

本发明上述步骤(1)中加入萃取液的体积为800μl，以确保待测物质能够从样本中完全提取出来；复溶液的体积为150μl，以确保待测物质能够从样本中完全复溶出来。

本发明上述步骤(1)中加入萃取液和复溶液混合离心为低温高速离心，即在5-10℃、优选8℃下15000rpm离心。离心过程优选在低温下进行以保证样本物质稳定，高速配合离心以使上清液更干净，保护仪器和色谱柱。

本发明的优点和有益效果：

采用本发明试剂盒来处理血清样本，通过简单的液液萃取(一步萃取)前处理方法，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得非常干净的处理液，通过浓缩得到较高的灵敏度，而且所需分析时间少，9min内就完成了5种抗癫痫药物和内标的分离，提高了检测的速度；采用梯度洗脱方式，更能保护色谱柱的效能，可与液相色谱仪配套使用，适用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测血清中苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物的浓度，达到单样本多指标同步检测功能，具有准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉等特点。

附图说明

图1为本发明苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物的化学结构式。

图2为本发明苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物与内标标准溶液的色谱图。

图3为本发明空白血清样品的色谱图。

图4为本发明苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物实测血清样品的色谱图。

图5为拉莫三嗪的标准曲线，线性范围：(1.00～40.00)μg/ml。

图6为苯巴比妥的标准曲线，线性范围：(2.00～80.00)μg/ml。

图7为奥卡西平的标准曲线，线性范围：(1.50～60.00)μg/ml。

图8为卡马西平的标准曲线，线性范围：(1.50～60.00)μg/ml。

图9为苯妥英的标准曲线，线性范围：(2.00～80.00)μg/ml。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1：

1.校准品母液：使用甲醇为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：

拉莫三嗪：10.00μg/ml、20.00μg/ml、50.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml；

苯巴比妥：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

奥卡西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

卡马西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

苯妥英：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

上述校准品母液均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；每一个浓度点的母液中总均含有拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英，一般均是每一个浓度点的母液中上述五种物质的浓度是上述6个浓度点浓度中低浓度到高浓度对应配比形成，如第一个浓度点的校准品母液中拉莫三嗪10.00μg/ml、苯巴比妥20.00μg/ml、奥卡西平15.00μg/ml，卡马西平15.00μg/ml、苯妥英20.00μg/ml，依次每一种浓度点母液中五种物质的浓度就按照这种方式对应，后面实施例亦同；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×40/200；

2.内标：酮洛芬的甲醇溶液，酮洛芬在溶液中的浓度为500μg/ml；

3.质控品：包括质控品1和质控品2，其中

质控品1的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：4.28μg/ml；苯巴比妥：9.84μg/ml；奥卡西平：7.46μg/ml；卡马西平：4.82μg/ml；苯妥英：5.03μg/ml；

质控品2的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：12.61μg/ml；苯巴比妥：41.27μg/ml；奥卡西平：19.80μg/ml；卡马西平：12.51μg/ml；苯妥英：25.54μg/ml；

质控品1和质控品2均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合物；各个成分的浓度为在质控品1或质控品2的混合物中的各自浓度(质控品可以是冻干粉、血清基质或甲醇溶液基质形式，此处用的是冻干粉基质形式的质控品，后面的实施例亦同)；

4.基质校正液：空白血清冻干粉(1ml空白血清冻成的冻干粉)，使用时，精密量取1ml纯化水至瓶中，混合30min至冻干粉完全溶解；

5.萃取液：叔丁基甲基醚溶液(即100％的叔丁基甲基醚)；

6.复溶液：体积比为50％的甲醇水溶液；

7.流动相：流动相a(0.1％甲酸水溶液)，流动相b(0.05％甲酸乙腈溶液)。

利用上述试剂盒进行检测，步骤如下：

(1)检测样本处理

①在室温下，准确吸取40μl校准品母液于离心管中，45℃氮气吹干后加入200μl基质校正液，漩涡混合后，再加入100μl含有已知浓度的内标，漩涡混合1min后加入800μl萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，15000r/min离心2min，取上清液45℃氮气吹干；再加入150μl复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清120μl加入到进样瓶中用于色谱分析；

②质控品/血清样本：在室温下，准确吸取200μl质控品/血清样本于离心管中，再加入100μl含有已知浓度的内标，漩涡混合1min后加入800μl萃取液，漩涡混合5min以使其完全混匀，15000r/min离心2min，取上清液45℃氮气吹干；再加入150μl复溶液复溶，漩涡混合后，15000r/min离心5min，取上清120μl加入到进样瓶中用于色谱分析；

(2)样本检测分析

(2.1)色谱条件

·色谱柱：c18柱或者相当；

·流动相：流动相a和流动相b；

·检测波长：拉莫三嗪(265nm)；苯巴比妥和苯妥英(230nm)；奥卡西平(240nm)；

卡马西平(284nm)；

·流速：0.5ml/min；

·梯度洗脱：按下表2所示；

表2

上表中的梯度洗脱过程，流动相中流动相a和流动相b体积比例随时间不断调整变化，以流动相b的占比变化为体现。

·柱温：40℃；

·进样器温度：8℃；

·进样量：8μl；

实施例2：

1.校准品母液：使用甲醇为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：

拉莫三嗪：10.00μg/ml、20.00μg/ml、50.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml；

苯巴比妥：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

奥卡西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

卡马西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

苯妥英：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

上述校准品母液均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×40/200；

2.内标：酮洛芬的甲醇溶液，浓度为500μg/ml；

3.质控品：包括质控品1和质控品2，其中

质控品1的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：4.28μg/ml；苯巴比妥：9.84μg/ml；奥卡西平：7.46μg/ml；卡马西平：4.82μg/ml；苯妥英：5.03μg/ml；

质控品2的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：12.61μg/ml；苯巴比妥：41.27μg/ml；奥卡西平：19.80μg/ml；卡马西平：12.51μg/ml；苯妥英：25.54μg/ml；

质控品1和质控品2均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合物；各个成分的浓度为在质控品1或质控品2的混合物中的各自浓度；

4.基质校正液：空白血清冻干粉(1ml空白血清冻成的冻干粉)，使用时，精密量取1ml纯化水至瓶中，混合30min至冻干粉完全溶解；

5.萃取液：叔丁基甲基醚溶液(即100％的叔丁基甲基醚)；

6.复溶液：100％的甲醇溶液；

7.流动相：流动相a(0.1％甲酸水溶液)，流动相b(0.05％甲酸乙腈溶液)。

利用上述试剂盒进行检测，方法同实施例1。

实施例3：

1.校准品母液：使用甲醇为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：

拉莫三嗪：10.00μg/ml、20.00μg/ml、50.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml；

苯巴比妥：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

奥卡西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

卡马西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

苯妥英：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

上述校准品母液均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×40/200；

2.内标：酮洛芬的甲醇溶液，浓度为500μg/ml；

3.质控品：包括质控品1和质控品2，其中

质控品1的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：4.28μg/ml；苯巴比妥：9.84μg/ml；奥卡西平：7.46μg/ml；卡马西平：4.82μg/ml；苯妥英：5.03μg/ml；

质控品2的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：12.61μg/ml；苯巴比妥：41.27μg/ml；奥卡西平：19.80μg/ml；卡马西平：12.51μg/ml；苯妥英：25.54μg/ml；

质控品1和质控品2均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合物；各个成分的浓度为在质控品1或质控品2的混合物中的各自浓度；

4.基质校正液：空白血清冻干粉(1ml空白血清冻成的冻干粉)，使用时，精密量取1ml纯化水至瓶中，混合30min至冻干粉完全溶解；

5.萃取液：叔丁基甲基醚溶液(即100％的叔丁基甲基醚)；

6.复溶液：体积比为50％的乙腈水溶液；

7.流动相：流动相a(0.05％甲酸水溶液)，流动相b(0.05％甲酸乙腈溶液)。

利用上述试剂盒进行检测，方法同实施例1。

实施例4：

1.校准品母液：使用甲醇为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：

拉莫三嗪：10.00μg/ml、20.00μg/ml、50.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml；

苯巴比妥：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

奥卡西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

卡马西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

苯妥英：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

上述校准品母液均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×40/200；

2.内标：酮洛芬的甲醇溶液，浓度为500μg/ml；

3.质控品：包括质控品1和质控品2，其中

质控品1的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：4.28μg/ml；苯巴比妥：9.84μg/ml；奥卡西平：7.46μg/ml；卡马西平：4.82μg/ml；苯妥英：5.03μg/ml；

质控品2的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：12.61μg/ml；苯巴比妥：41.27μg/ml；奥卡西平：19.80μg/ml；卡马西平：12.51μg/ml；苯妥英：25.54μg/ml；

质控品1和质控品2均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合物；各个成分的浓度为在质控品1或质控品2的混合物中的各自浓度；

4.基质校正液：空白血清冻干粉(1ml空白血清冻成的冻干粉)，使用时，精密量取1ml纯化水至瓶中，混合30min至冻干粉完全溶解；

5.萃取液：叔丁基甲基醚溶液(即100％的叔丁基甲基醚)；

6.复溶液：体积比为100％的乙腈水溶液；

7.流动相：流动相a(0.1％甲酸水溶液)，流动相b(0.1％甲酸乙腈溶液)。

利用上述试剂盒进行检测，方法同实施例1。

实施例5：

1.校准品母液：使用甲醇为稀释液，配制包括6个浓度点的校准品母液，校准品母液的6个浓度点依次为：

拉莫三嗪：10.00μg/ml、20.00μg/ml、50.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml；

苯巴比妥：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

奥卡西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

卡马西平：15.00μg/ml、30.00μg/ml、75.00μg/ml、150.00μg/ml、300.00μg/ml、600.00μg/ml；

苯妥英：20.00μg/ml、40.00μg/ml、100.00μg/ml、200.00μg/ml、400.00μg/ml、800.00μg/ml；

上述校准品母液均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合溶液；六个点的浓度为各个成分在总的混合溶液中的浓度；校准品工作液的浓度＝校准品母液浓度×40/200；

2.内标：酮洛芬的甲醇溶液，浓度为500μg/ml；

3.质控品：包括质控品1和质控品2，其中

质控品1的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：4.28μg/ml；苯巴比妥：9.84μg/ml；奥卡西平：7.46μg/ml；卡马西平：4.82μg/ml；苯妥英：5.03μg/ml；

质控品2的浓度范围和成分包括：拉莫三嗪：12.61μg/ml；苯巴比妥：41.27μg/ml；奥卡西平：19.80μg/ml；卡马西平：12.51μg/ml；苯妥英：25.54μg/ml；

质控品1和质控品2均为拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的混合物；各个成分的浓度为在质控品1或质控品2的混合物中的各自浓度；

4.基质校正液：空白血清冻干粉(1ml空白血清冻成的冻干粉)，使用时，精密量取1ml纯化水至瓶中，混合30min至冻干粉完全溶解；

5.萃取液：叔丁基甲基醚溶液(即100％的叔丁基甲基醚)；

6.复溶液：体积比为50％的甲醇水溶液；

7.流动相：流动相a(0.2％甲酸水溶液)，流动相b(0.2％甲酸乙腈溶液)。

利用上述试剂盒进行检测，方法同实施例1。

对实施例1-5得到的处理好的校准品、质控品和样本各8μl注入液相色谱仪，记录色谱图，按照如下步骤进行检测结果的计算：

(1)校准曲线的绘制与拟合：一般液相色谱分析软件可根据校准结果自动绘制校准曲线，以6个校准品工作液与内标的浓度比为横坐标(x)，以6个校准品工作液的实际测定峰面积与各自内标峰面积的比值为纵坐标(y)，用最小二乘法进行线性回归，自动绘制标准曲线，可获得回归方程：y＝ax+b，其中y为纵坐标，x为横坐标，a为斜率，b为截距，并计算r(相关系数)值，r值≥0.9900；

(2)回收率的计算：质控品各分析物的测定浓度可根据质控品中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得，其回收率的计算公式为：回收率(％)＝测定浓度/标示浓度×100，回收率(％)应在85％-115％范围内；

(3)样本结果的计算：样本中的各分析物测定浓度可根据样本中各分析物及对应内标的峰面积的比值由校准曲线获得。

图1为本发明苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物的化学结构式；图2为本发明苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物与内标标准溶液的色谱图；图3为本发明空白血清样品的色谱图；图4为本发明苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物实测血清样品的色谱图。

实施例1-5的检测结果基本一致，下面结合相关附图对实施例1试剂盒分析性能进行说明：

1.标准曲线与线性：图5拉莫三嗪标准曲线线性范围：(1.00～40.00)μg/ml。图6苯巴比妥标准曲线线性范围：(2.00～80.00)μg/ml。图7奥卡西平标准曲线线性范围：(1.50～60.00)μg/ml。图8卡马西平标准曲线线性范围：(1.50～60.00)μg/ml。图9苯妥英标准曲线线性范围：(2.00～80.00)μg/ml。由图可知，拉莫三嗪、苯巴比妥、奥卡西平、卡马西平和苯妥英的相关系数r都大于0.99，线性良好。

2.准确度和精密度

分别对质控品1和质控品2进行测定，结果如下表3所示：

表3质控品1和质控品2测定结果

从上述检测结果可知，本发明试剂盒及液相色谱检测方法具有良好的准确度、精密度和线性，能完全满足临床检测要求，同时采用本发明试剂盒来处理血清样本，无需进行复杂的净化提纯步骤就可以获得非常干净的处理液，通过浓缩得到较高的灵敏度，而且所需分析时间少，5-9min内就完成了5种抗癫痫药物和内标的分离，提高了检测的速度；采用梯度洗脱方式，更能保护色谱柱的效能，可与液相色谱仪配套使用，适用于临床样本的检验；同时，该产品能同时检测血清中苯巴比妥、苯妥英、卡马西平、奥卡西平和拉莫三嗪5种抗癫痫药物的浓度，达到单样本多指标同步检测功能，具有准确率高、检测时间短、试剂耗用量少、操作方便和成本低廉等特点。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合检验检疫领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。