血浆中氧化三甲胺含量的检测方法及检测试剂盒与流程

本发明涉及医学生物检测技术领域，具体地涉及血浆中氧化三甲胺含量的检测方法及检测试剂盒。

背景技术：

心血管疾病目前是中国城乡居民死亡原因的首位，高于肿瘤和其他疾病。最新发布的《中国心血管病报告2017》数据表明：中国心血管病患病率及死亡率仍处于持续上升阶段，推算全国有心血管病患者2.9亿，其中脑卒中1300万，冠心病1100万，肺心病500万，心力衰竭45万，风心病250万，高血压2.7亿。中国30％的人口存在≥3个心血管危险因素，即近4亿人口同时存在≥3个心血管危险因素。我国心血管病防治工作已取得初步成效但仍面临严峻挑战。总体上看，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段。心血管病死亡占城乡居民疾病死亡构成的40％以上，居首位，高于肿瘤及其他疾病。心血管病的疾病负担日渐加重，已成为重大的公共卫生问题，在政府发布的《中国慢性病防治工作规划》中就明确指出：慢病防治最关键的部分就在于提高疾病的风险预测，即做到早发现、早治疗。氧化三甲胺(tmao)是由肠道细菌消化红肉、鸡蛋、乳制品、咸水鱼收后，再经过肝脏加工产生的一种极性小分子化合物。近年来，随着肠道菌群研究的深入，科学家们发现tmao与心血管疾病、脑卒中、糖尿病、慢性肾病、癌症等多种疾病密切相关，因此tmao越来越受到广泛关注。tmao是一个新型的预测心脑血管疾病风险的生物标记物，能很好的独立预测心脑血管疾病的风险。tmao定量分析可为心脑血管疾病的诊断、风险分层和预测等方面提供可靠的依据。tmao浓度升高与主要不良心血管事件的风险是呈现显著相关性的，并且相对风险的增加不随身体质量指数、糖尿病、心血管疾病史、肾功能障碍等因素的变化而变化，并且可在通过传统危险因素以及血液检测无法识别的人群中作为预测将来心脏病发作、脑卒中和死亡风险的一种准确筛查工具。代谢小分子氧化三甲胺检测与胆固醇、甘油三酯或血糖水平一样有助于指导临床医师提供个体化营养建议以预防心血管疾病。

传统的tmao检测方法为分光光度法、毛细管电泳法及色谱法，其灵敏度和准确度有限、重复性差。液相色谱串联质谱法(lc-ms/ms)具有分析时间短、灵敏度高、特异性高等优点，显示极高优越性和应用前景，是目前tmao检测最常用的方法。可利用稳定同位素标记化合物作为内标，有效消除基质干扰，极大的提高特异性。

目前已报道串联质谱法检测tmao文献及专利中使用的蛋白沉淀剂，主要是甲醇或乙腈。一般用甲醇沉淀蛋白的优点是增加血浆中待测小分子的释放率，避免待测物质的损失，但同时也因提取过多的内源性杂质而造成很强的离子抑制，即在血浆样本中的氘代内标信号要比在空白溶剂中的内标信号低一些。因为空白溶剂中的基质比较干净，对离子的抑制不明显，通过氘代内标在血浆样本中的响应与其在空白样本中的响应之差，该差与氘代内标在空白样本中的响应比值来计算离子抑制。如果离子抑制太大，说明血浆前处理不干净，长期会造成色谱柱和仪器的污染、堵塞，严重降低色谱柱和仪器的使用寿命。

乙腈与之相反，沉淀能力比甲醇强，离子抑制会明显减弱，但在处理临床高脂血浆样本时容易导致待测物质损失，从而导致错误的诊断。

目前蛋白沉淀法的离子抑制一般都很强，即经过蛋白沉淀前处理后的上机液对色谱柱及质谱仪的影响较大。因此，需提供一种综合性能较强的蛋白沉淀剂，既能有效的降低色谱柱及质谱仪的污染，又可避免在处理高脂血浆样本时导致错误的诊断。此外，目前已报道串联质谱法检测tmao文献及专利中的检测速度较慢，一般在2.5-20min，需要开发更快的检测方法来满足临床大批量样本快速检测的需求。

因此，本领域需要开发一种能提高tmao释放率和降低离子抑制率的血浆蛋白沉淀剂，通过液质联用能够快速和准确测定分析血浆中tmao的含量，从而为疾病的诊断提供支持。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于通过液质联用检测血样中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂对血浆进行前处理后，既能提高tmao从血样中的释放率，又能降低离子抑制率，从而降低tmao的损失，提高液质联用检测的准确度和降低高效液相-质谱被污染的风险，从而避免在处理血样导致错误的诊断结果。

本发明第一方面，提供一种用于通过液质联用检测血样中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂，所述的蛋白沉淀剂包括：

(i)组分a，所述的组分a为乙醇；

(ii)组分b，所述的组分b为乙腈；和

(ii)组分c，所述的组分c为甲酸；

所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(22-40)：(60-78)：(0.2-0.8)。

在另一优选例中，所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(22-30)：(70-78)：(0.3-0.7)。

在另一优选例中，所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(25-29)：(70-75)：(0.4-0.6)。

在另一优选例中，所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(27-35)：(65-73)：(0.5-0.7)。

在另一优选例中，所述的组分a的体积份数由22-40％(v/v)，较佳地22-30％(v/v)，更佳地25-29％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的组分b的体积份数由60-78％(v/v)，较佳地70-78％(v/v)，更佳地70-75％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的组分c的体积份数由0.2-0.8％(v/v)，较佳地0.3-0.7％(v/v)，，更佳地0.4-0.6％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的组分a的体积份数由27-35％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的组分b的体积份数由65-73％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的组分c的体积份数由0.5-0.7％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的蛋白沉淀剂中，各个组分的重量百分比之和为100％。

在另一优选例中，所述的蛋白沉淀剂中，各个组分是相互独立的。

在另一优选例中，所述的蛋白沉淀剂中，各个组分是混合在一起。

在另一优选例中，所述的血样选自下组：血液、血清、血浆，或其组合。

在另一优选例中7，所述的血液为外周全血。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血样。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血浆。

在另一优选例中，所述的高血脂为高甘油三酯和/或高胆固醇。

本发明第二方面，提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括如本发明第一方面所述的蛋白沉淀剂。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒还包括氧化三甲胺标准品和/或内标品。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒还包括第一容积，所述的第一容积包括如本发明第一方面所述的蛋白沉淀剂。

在另一优选例中，所述的第一容积包括第一子容器、第二子容器和第三子容器，所述的第一子容器包括组分a，所述的第二子容器包括组分b和所述的第三子容器包括组分c。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括：

(1)0.1、0.5、2、5、10、20及50μm氧化三甲胺标准溶液，所述氧化三甲胺标准溶液的配制基质为50％甲醇水溶液；

(2)内标溶液，所述的内标溶液为2-7μm(优选为5μm)的tmao-d9甲醇溶液；

(3)如本发明第一方面所述的蛋白沉淀剂；

(4)质控品i和质控品ii，所述的质控品i和质控品ii通过以下方法制备：取适量seralab碳吸附人血浆作为质控i，浓度为1-5μm(较佳地2.9μm)；在质控i上加入少量0.5-3mmol/l(较佳地1mmol/l)的tmao标准品储备液配制质控ii，浓度为18-30μm(较佳地23.5μm)；

(5)流动相a；

(6)流动相b；

在另一优选例中，所述的氧化三甲胺标准溶液为0.1、0.5、2、5、10、20及50μm氧化三甲胺标准溶液，所述氧化三甲胺标准溶液的配制基质为30-60％(优选为50％)甲醇水溶液。

本发明第三方面，提供一种体外非治疗性和非诊断性检测血样中氧化三甲胺含量的方法，所述的方法包括步骤：

(1)将如本发明第一方面所述的蛋白沉淀剂加入到待测血样中，使待测血样中的蛋白沉淀后，取上清液，通过高效液相-质谱联用测定分析待测血样中氧化三甲胺含量。

在另一优选例中，所述的高效液相的色谱条件为：

色谱柱：反相色谱柱；

流动相：流动相a和流动相b，所述的流动相a包括0.05-0.4％(v/v)甲酸和0.03-0.2％(v/v)氨水的水溶液，以流动相a的总体积计算；所述的流动相b包括0.5-6mm甲酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈的体积分数为70-96％(v/v)，以流动相b的总体积计算；和

流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：

色谱柱温度：15-45℃，较佳地30-40℃；

进样室温度：2-20℃，较佳地5-15℃；

流动相(流动相a+流动相b)流速：0.1-1.5ml/min，较佳地0.2-1.0ml/min，更佳地0.2-0.6ml/min，最佳地0.3-0.5ml/min；

运行时间：≤1min，较佳地≤0.5min，更佳地0.3-0.5min。

在另一优选例中，所述的反相色谱柱为acquityuplcbeht3。

在另一优选例中，所述的反相色谱柱的规格为(1.8-2.5)×(40-200)mm，1.5-2.3μm)。

在另一优选例中，所述的反相色谱柱的规格为(2.1×50mm，1.8μm)。

在另一优选例中，所述的反相色谱柱为acquityuplcbeht3(2.1×50mm，1.8μm)。

在另一优选例中，所述的流动相a包括0.05-0.2％(v/v)甲酸和0.03-0.1％(v/v)氨水的水溶液，以流动相a的总体积计算。

在另一优选例中，所述的流动相b包括1-4mm甲酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈的体积分数为80-95％(v/v)，以流动相b的总体积计算。

在另一优选例中，所述的流动相a包括0.08-0.12％(v/v)甲酸和0.03-0.07％(v/v)氨水的水溶液，以流动相a的总体积计算。

在另一优选例中，所述的流动相b包括1.5-2.5mm甲酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈的体积分数为85-95％(v/v)，以流动相b的总体积计算。

在另一优选例中，所述的血样选自下组：血液、血清、血浆，或其组合。

在另一优选例中，所述的血液为外周全血。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血样。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血浆。

在另一优选例中，所述的高血脂为高甘油三酯和/或高胆固醇。

本发明第四方面，提供一种如本发明第一方面所述的蛋白沉淀剂的用途，用于制备通过液质联用检测血样中氧化三甲胺含量的的检测试剂盒。

在另一优选例中，所述的血样选自下组：血液、血清、血浆，或其组合。

在另一优选例中，所述的血液为外周全血。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血样。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血浆。

在另一优选例中，所述的高血脂为高甘油三酯和/或高胆固醇。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒还包括说明书，所述的说明书注明所述的蛋白沉淀剂对血样进行处理后，通过液质联用检测血样中氧化三甲胺含量。

在另一优选例中，所述的蛋白沉淀剂对血样进行处理后，通过液质联用检测血样中氧化三甲胺含量方法包括步骤：

(1)将如本发明第一方面所述的蛋白沉淀剂加入到待测血样中，使待测血样中的蛋白沉淀后，取上清液，通过高效液相-质谱联用测定分析待测血样中氧化三甲胺含量。

在另一优选例中，所述的蛋白沉淀剂对血样进行处理后，通过液质联用检测血样中氧化三甲胺含量的方法为如本发明第三方面所述的方法。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为实施例1得到的tmao标准品溶液的标准回归曲线，其中，化合物名称:tmao，m/z:76.15>58.15，标准曲线公式:f(x)＝0.158262*x+0.00881566，相关系数(r)＝0.9998拟合度(r^2)＝0.9996。

图2为实施例1中待测血浆样本1的tmao和tmao-d9液质色谱图(蛋白沉淀剂由体积比依次为27：73：0.5的乙醇、乙腈和甲酸组成)。

图3为实施例1中空白(50％甲醇水)对照直接进样于液质联用仪后，tmao和tmao-d9液质色谱图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而又深入的研究，意外的发现一种用于通过液质联用检测血样中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂，所述的蛋白沉淀剂包括：(i)组分a，所述的组分a为乙醇；(ii)组分b，所述的组分b为乙腈；和(ii)组分c，所述的组分c为甲酸；所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(22-40)：(60-78)：(0.2-0.8)。本发明所述的蛋白沉淀剂对血浆进行前处理后，既能提高tmao从血样中的释放率，又能降低离子抑制率，从而降低tmao的损失，提高液质联用检测的准确度和降低高效液相-质谱被污染的风险，从而避免在处理血样(如高脂血浆样本)导致错误的诊断结果。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，术语“液-质联用”为高效液相-质谱联用的简称，即“液-质联用”与“高效液相-质谱联用”可互换使用。

如本文所用，术语“氧化三甲胺”简称tmao，即“氧化三甲胺”与“tmao”可互换使用。

如本文所用，术语“高效液相色谱”简称hplc，即“高效液相色谱”与“hplc”可互换使用。

在本发明中，应当理解的是，所述的流动相流速为流动相a和流动相b的流速之和。

如本文所用，对于一个数值范围p1至p2，则该范围不仅包括端点p1和p2，还包括介于端点p1和p2的任何数值点。在一个优选例中，在本发明所述的蛋白沉淀剂中，所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(22-40)：(60-78)：(0.2-0.8)，其中22-40、60-78之间的点包括22-40、60-78之间的任何正整数点，0.2-0.8之间的点包括0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8之间的点。在另一优选例中，所述的组分a的体积份数由22-40％(v/v)，较佳地22-30％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算，其中，22-40、22-30之间的点包括22-40、22-30之间的任何正整数点。在另一优选例中，所述的组分b的体积份数由60-78％(v/v)，较佳地70-78％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算，其中，60-78、70-78之间的点包括60-78、70-78之间的任何正整数点。在另一优选例中，所述的组分c的体积份数由0.2-0.8％(v/v)，较佳地0.3-0.7％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算，其中，0.2-0.8之间的点包括0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8的点。

蛋白沉淀剂

本发明提供一种用于通过液质联用检测血样中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂，所述的蛋白沉淀剂包括：

(i)组分a，所述的组分a为乙醇；

(ii)组分b，所述的组分b为乙腈；和

(ii)组分c，所述的组分c为甲酸；

所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(22-40)：(60-78)：(0.2-0.8)。

应当理解的是，在本发明所述的蛋白沉淀剂中，“用于通过液质联用检测血样中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂”与“蛋白沉淀剂”可互换使用。

在一个优选例中，所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(22-30)：(70-78)：(0.3-0.7)。

在另一优选例中，所述的组分a、组分b和组分c的体积比(v/v/v)依次为(25-29)：(70-75)：(0.4-0.6)。

在另一优选例中，所述的组分a的体积份数由22-40％(v/v)，较佳地22-30％(v/v)，更佳地25-29％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的组分b的体积份数由60-78％(v/v)，较佳地70-78％(v/v)，更佳地70-75％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在另一优选例中，所述的组分c的体积份数由0.2-0.8％(v/v)，较佳地0.3-0.7％(v/v)，更佳地0.4-0.6％(v/v)，以所述蛋白沉淀剂的总体积计算。

在本发明的一个优选例中，所述的血样包括(但不限于)：血液、血清、血浆，或其组合。

优选地，所述的血液为外周全血。

优选地，所述的血样为高血脂血样。

优选地，所述的血样为高血脂血浆。

优选地，所述的高血脂为高甘油三酯和/或高胆固醇。

试剂盒

本发明还提供一种检测试剂盒，所述的检测试剂盒包括本发明所述的用于通过液质联用检测血样中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂。

在一个优选例中，所述的检测试剂盒还包括氧化三甲胺标准品和/或内标品。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒还包括第一容积，所述的第一容积包括如本发明所述的蛋白沉淀剂。

在另一优选例中，所述的第一容积包括第一子容器、第二子容器和第三子容器，所述的第一子容器包括组分a，所述的第二子容器包括组分b和所述的第三子容器包括组分c。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒包括：

(1)0.1、0.5、2、5、10、20及50μm氧化三甲胺标准溶液，所述氧化三甲胺标准溶液的配制基质为50％甲醇水溶液；

(2)内标溶液，所述的内标溶液为2-7μm(优选为5μm)的tmao-d9甲醇溶液；

(3)如本发明所述的蛋白沉淀剂；

(4)质控品i和质控品ii，所述的质控品i和质控品ii通过以下方法制备：取适量seralab碳吸附人血浆作为质控i，浓度为1-5μm(较佳地2.9μm)；在质控i上加入少量0.5-3mmol/l(较佳地1mmol/l)的tmao标准品储备液配制质控ii，浓度为18-30μm(较佳地23.5μm)；

(5)流动相a；

(6)流动相b；

在另一优选例中，所述的氧化三甲胺标准溶液为0.1、0.5、2、5、10、20及50μm氧化三甲胺标准溶液，所述氧化三甲胺标准溶液的配制基质为30-60％(优选为50％)甲醇水溶液。

体外非治疗性和非诊断性检测血样中氧化三甲胺含量的方法

本发明还提供一种体外非治疗性和非诊断性检测血样中氧化三甲胺含量的方法，所述的方法包括步骤：

(1)将本发明所述的蛋白沉淀剂加入到待测血样中，使待测血样中的蛋白沉淀后，取上清液，通过高效液相-质谱联用测定分析待测血样中氧化三甲胺含量。

在一个优选例中，所述的高效液相的色谱条件为：

色谱柱：反相色谱柱；和

流动相：流动相a和流动相b，所述的流动相a包括0.05-0.4％(v/v)甲酸和0.03-0.2％(v/v)氨水的水溶液，以流动相a的总体积计算；所述的流动相b包括0.5-6mm甲酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈的体积分数为70-96％(v/v)，以流动相b的总体积计算；和

流动相洗脱：所述的流动相洗脱为梯度洗脱，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，所述的梯度洗脱的顺序为：

在另一优选例中，所述的高效液相还具有选自下组的一种或多种色谱条件：

色谱柱温度：15-45℃，较佳地30-40℃；

进样室温度：2-20℃，较佳地5-15℃；

流动相(流动相a+流动相b)流速：0.1-1.5ml/min，较佳地0.2-1.0ml/min，更佳地0.2-0.6ml/min，最佳地0.3-0.5ml/min；

运行时间：≤1min，较佳地≤0.5min，更佳地0.3-0.5min。

在另一优选例中，所述的反相色谱柱为acquityuplcbeht3。

在另一优选例中，所述的反相色谱柱的规格为(1.8-2.5)×(40-200)mm，1.5-2.3μm)。典型地，所述的反相色谱柱的规格为(2.1×50mm，1.8μm)。

代表性的，所述的反相色谱柱为acquityuplcbeht3(2.1×50mm，1.8μm)。

在另一优选例中，所述的流动相a包括0.05-0.2％(v/v)甲酸和0.03-0.1％(v/v)氨水的水溶液，以流动相a的总体积计算。

在另一优选例中，所述的流动相a包括0.08-0.12％(v/v)甲酸和0.03-0.07％(v/v)氨水的水溶液，以流动相a的总体积计算。

在另一优选例中，所述的流动相b包括1-4mm甲酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈的体积分数为80-95％(v/v)，以流动相b的总体积计算。

在另一优选例中，所述的流动相b包括1.5-2.5mm甲酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈的体积分数为85-95％(v/v)，以流动相b的总体积计算。

在本发明所述的体外非治疗性和非诊断性检测血样中氧化三甲胺含量的方法中，所述的血样(包括但不限于)：血液、血清、血浆，或其组合。

优选地，所述的血液为外周全血。

优选地，所述的血样为高血脂血样。

优选地，所述的血样为高血脂血浆。

优选地，所述的高血脂为高甘油三酯和/或高胆固醇。

用途

本发明还提供一种本发明所述的蛋白沉淀剂的用途，用于制备通过液质联用检测血样中氧化三甲胺含量的检测试剂盒。

在另一优选例中，所述的检测试剂盒还包括说明书，所述的说明书注明所述的蛋白沉淀剂通过液质联用检测血样中氧化三甲胺含量。

在本发明的另一优选例中，如本发明所述的蛋白沉淀剂、如本发明所述的检测试剂盒、如本发明所述的体外非治疗性和非诊断性检测血样中氧化三甲胺含量的方法、和/或如本发明所述的用途，所述的血样选自下组：血液、血清、血浆，或其组合。

在另一优选例中，所述的血液为外周全血。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血样。

在另一优选例中，所述的血样为高血脂血浆。

在另一优选例中，所述的高血脂为高甘油三酯和/或高胆固醇。

本发明的主要优点包括：

1、本发明提供一种用于液质(高效液相-质谱)联用待测血样(如高脂血浆样本)中氧化三甲胺的蛋白沉淀剂，所述的蛋白沉淀剂对血浆进行前处理，既能提高tmao从血样中的释放率，又能降低离子抑制率，从而降低tmao的损失，提高液质联用检测的准确度和降低高效液相-质谱被污染的风险，从而避免在处理血样(如高脂血浆样本)导致错误的诊断结果。

2、本发明所述蛋白沉淀剂对待测血样中进行处理后，上清液可直接进样于液质联用仪，操作简单，且进样分析时间1min内即可完成等优点，因此，检测速度快，适于大规模推广应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

1、主要仪器与设备：

岛津lc-ms8050；labsolutionsinsight软件。

2、试剂与材料：

氧化三甲胺标准品、氧化三甲胺-d9标准品、甲醇、乙腈、乙醇、甲酸、氨水、碳吸附人血浆皆为市售试剂。

3、液相色谱和质谱分析条件：

色谱条件：

色谱柱：acquityuplcbeht3(2.1×50mm，1.8μm)；流动相a：0.1％(v/v)甲酸+0.05％(v/v)氨水的水溶液；流动相b：2mm甲酸铵的乙腈水溶液，其中乙腈的体积分数为90％(v/v)，以流动相b的总体积计；流速0.4ml/min：柱温35℃：进样室温度：8℃；进样量1μl；洗针液：50％甲醇水。

流动相梯度方法：

质谱条件：

采用电喷雾离子源(esi)，正离子mrm模式检测；tmao：监测离子m/z76.15＞58.15；q1pre偏差(v)：-16.0v，碰撞能：-17.0ev，q3pre偏差(v)：-20.0v；tmao-d9：监测离子m/z85.15＞66.25，q1pre偏差(v)：-15.0v，碰撞能：-23.0ev，q3pre偏差(v)：-25.0v；雾化气流量2.5l/min，加热气流量10l/min；干燥气流量10l/min；接口温度：300℃；dl温度：250℃；加热块温度：400℃；

4、实验过程：

4-1溶液配制

4-1-1氧化三甲胺标准曲线溶液配制：

精密称取氧化三甲胺标准品适量，用50％甲醇水溶液溶解后配制成浓度为1mmol/l的氧化三甲胺标准品储备液。再用50％甲醇水溶液将浓度为1mmol/l的氧化三甲胺标准品储备液依次稀释为标准曲线工作溶液，其浓度从低到高依次为0.1、0.5、2、5、10、20及50μmol/l。

4-1-2tmao-d9内标溶液配制：

精密称取氘代同位素内标品tmao-d9适量，用甲醇溶解得到5μmol/l的tmao-d9内标溶液。

4-1-3蛋白沉淀剂

所述的蛋白沉淀剂乙醇、乙腈和甲酸，且乙醇、乙腈和甲酸的体积比依次为(22-40)：(60-78)：(0.2-0.8)。

4-1-4tmao-d9和蛋白沉淀剂的混合液

用蛋白沉淀剂稀释5μmol/l的tmao-d9内标溶液至1μmol/ltmao-d9，得到tmao-d9与蛋白沉淀剂的混合液。

4-2质控品i和质控品ii的配制：

取适量seralab碳吸附人血浆作为质控i，靶值为2.9μm，质控i有效范围：2.7～3.2μm；在质控i上加入少量1mmol/l的氧化三甲胺标准品储备液配制质控ii，靶值为23.5μm，质控ii有效范围：21.3～25.7μm。

4-3血浆样本的前处理及进样分析：

分别将0.1μm、0.5μm、2μm、5μm、10μm、20μm、50μm氧化三甲胺标准品标准液、质控品i、质控品ii和待测血浆样本各25μl加入到96孔板的不同孔中，然后向每个孔中依次加入100μltmao-d9和蛋白沉淀剂的混合液，振荡10s，4000rpm离心5min，取上清液80μl，分别进样1μl到液质联用仪，测定分析待测血浆样本中氧化三甲胺的含量(单位为μm)，从而评价蛋白沉淀剂对血浆蛋白的沉淀性能和对tmao的释放性能，其中，tmao的标准回归曲线如图1所示。

5、评价指标

释放率：tmao从血浆样品释放且被检测的量，释放率越大，表明tmao从血浆样品释放且被检测的量越多，tmao在蛋白沉淀过程中的损失越少，反之，释放率越小，表明tmao从血浆样品释放且被检测的量越少，tmao在蛋白沉淀过程中的的的损失越多。

离子抑制：因为空白溶剂中的基质比较干净，对离子的抑制不明显，通过氘代内标在血浆样本中的响应与其在空白样本中的响应之差，该差与氘代内标在空白样本中的响应比值来计算离子抑制。如果离子抑制太大，说明血浆蛋白沉淀前处理不干净，长期会造成色谱柱和仪器的污染、堵塞，严重降低色谱柱和仪器的使用寿命。

5、实验结果

不同的蛋白沉淀剂对待测血浆样本(样本1、样本2各取6次)中氧化三甲胺的测定分析结果下表1所示，其中，待测血浆样本(样本1、样本2)的信息如下表1所示：

表1实施例1中的血浆样本(样本1、样本2)信息

血浆中总胆固醇、甘油三酯的任何一个指标偏高都是高血脂样本。样本1的胆固醇正常，甘油三酯偏高，样本2的胆固醇和甘油三酯都偏高，即实施例1中的样本1和样本2均为高血脂样本。

在通过液质联用测定血浆样品氧化三甲胺含量的中，实施例1中采用的不同的蛋白沉淀剂对高血脂血浆样本1、样本2的沉淀性能如表2所示，其中图2为由体积比依次为27：73：0.5的乙醇、乙腈和甲酸组成蛋白沉淀剂处理血浆后，tmao和tmao-d9液质色谱图，从图2色谱图中可以看出，液质联用检测时间小于0.5min，检测时间短。图3为50％甲醇水直接进样于液质联用仪后，tmao和tmao-d9液质色谱图，从图3中可以看出，tmao和tmao-d9无响应值，表明检测过程中无干扰。

表2实施例1中的蛋白沉淀剂对高血脂血浆样本1、样本2的沉淀性能和tmao的释放性能(n＝6，均值)

从表2的数据可以看出，单使用甲醇为蛋白沉淀剂时测定tmao含量最高，可默认为使用甲醇后tmao的测定值为100％样本释放率，其它蛋白沉淀剂的检测结果与甲醇检测比较，计算使用其它蛋白沉淀剂时的样本相对释放率。从表2中可以看出，乙腈或乙腈加酸为蛋白沉淀剂时样本释放率降低明显，表明待测组分tmao损失较多，因此，乙腈或乙腈加酸不能单使用作为沉淀剂。

此外，单使用乙腈为蛋白沉淀剂时的离子抑制最小，相对沉淀率达到最高，可默认为使用乙腈后100％相对沉淀率，使用其他蛋白沉淀剂产生的离子抑制与乙腈比较，分别换算为对应的相对沉淀率。从表2中可以看出，使用甲醇为蛋白沉淀剂时相对沉淀率最低，说明血浆前处理不干净，长期会造成色谱柱和仪器的污染、堵塞，严重降低色谱柱和仪器的使用寿命，故不建议单使用甲醇为蛋白沉淀剂。

为保证检测结果的准确性，相对释放率要的可接受程度为95％以上，相对沉淀率的可接受程度为90％以上。从表2中可以看出，当蛋白沉淀剂为由体积比依次为(22-40)：(60-78)：(0.2-0.8)的乙醇、乙腈和甲酸组成时，相对释放率要为95％以上且相对沉淀率为90％以上，具有优异的沉淀性能和tmao释放性能，从而能够提高检测的准确度和降低高效液相-质谱被污染的风险，避免在处理血样(如高脂血浆样本)导致错误的诊断结果。

实施例2

实施例2通过选用另外4例高血脂血浆样本(样本3、样本4、样本5和样本6)和2例正常血脂样本(样本7和样本8)，再次验证由体积比依次为27：73：0.5的乙醇、乙腈和甲酸组成的蛋白沉淀剂的沉淀性能和tmao释放性能，具体测定方法参考实施例1(样本3-8平行3次)，其中，血浆样本3-8的信息如表3所示。

表3血浆样本3-8的信息如下

从表3中可以看出，实施例2中的样本3-6均为高血脂样本，样本7-8均为正常血脂样本。

在通过液质联用测定血浆样品氧化三甲胺含量的中，由体积比依次为27：73：0.5的乙醇、乙腈和甲酸组成的蛋白沉淀剂对血浆样本3-8的沉淀性能和tmao释放性能如表4所示。

表4实施例2中的蛋白沉淀剂对样本3-8的沉淀性能和tmao释放性能(n＝3，均值)

从表4中可见，用由体积比依次为27：73：0.5的乙醇、乙腈和甲酸组成的蛋白沉淀剂处理4例临床高血脂血浆样本3-6和2例正常血浆样本7-8，其沉淀性能和tmao释放性能均比较理想，相对释放率要的可接受程度为95％以上，相对沉淀率的可接受程度为90％以上，表明该蛋白沉淀剂可应用于准确测定血浆中氧化三甲胺的含量。

对比例1

对比例如实施例1相似，区别在于采用与实施例1不同的蛋白沉淀剂，对比例1不同的蛋白沉淀剂的沉淀性能和tmao释放性能如下表5所示。

表5对比例中的蛋白沉淀剂对高血脂血浆样本1、样本2的沉淀性能和tmao释放性能(n＝6，均值)

备注：当单独使用甲酸做沉淀剂时，无沉淀效果，无法对血浆样本进行前处理上机检测。

从表5中可以看出，当使用如表5所示的蛋白沉淀剂时均无法同时满足相对释放率为95％以上和相对沉淀率90％以上的质量要求，因此故已有的蛋白沉淀剂均没有达到理想效果。

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