本发明属于医学检测技术领域，涉及一种用于检测血清总蛋白的试剂及其制备方法。
背景技术：
血清总蛋白(totalprotein，tp)，可分为白蛋白和球蛋白两类，在机体中具有重要的生理功能，血清总蛋白的测定是临床生化检验的重要项目之一。血清蛋白具有维持血液正常胶体渗透压和ph、运输多种代谢物、调节被运输物质的生理作用和解除其毒性、免疫作用以及营养作用等多种功能。血清总蛋白不仅可用于机体营养状态的监测，还可用于疾病的诊断及鉴别诊断。
当血清总蛋白含量增高常见于呕吐，腹泻等急性失水性疾病，多发性骨髓瘤及肾上腺机能减退等；血清总蛋白含量降低可由蛋白质摄入不足，严重消耗性疾病如结核、甲亢、肿瘤等引起，肝功能严重损害，肾病综合症如溃疡性结肠炎等疾病均可表现为总蛋白浓度低下。
目前临床上常用的总蛋白检测方法有bca法、染料结合法、免疫比浊法和双缩脲比色法等。bca法是依据二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的bcasolution相互作用产生敏感的颜色反应；两分子的bca螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。其准确度高，灵敏度好，但是显色慢。比浊法是通过加入磺基水杨酸(ssa)、三氯乙酸(tca)、钨酸于尿液中，使蛋白质沉淀形成一定的浊度，然后通过比浊的方法检测蛋白质含量。该方法准确度较差，抗干扰能力差。染料结合法分为直接法和沉淀法两类；直接法是通过染料与蛋白质结合时，其最大吸收峰的漂移来检测的，该方法所用的染料有考马斯亮蓝g-250、邻苯三酚红和苯甲紫等。cn105572117a公开了一种适合全自动生化分析仪的尿总蛋白检测试剂盒，该试剂盒中含有邻苯三酚红、甲醇、钼酸钠、琥珀酸、草酸钠、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠和牛血清白蛋白，该检测试剂是领苯邻苯三酚红的基础上，优化反应体系得到的，但仍存在精测精度低的问题。双缩脲比色法是利用蛋白质在碱性溶液中可与cu2+形成紫色化合物，在一定浓度范围内，蛋白质浓度与紫色化合物颜色的深浅成正比。此方法简便、准备、重复性好，在较高浓度范围内呈现良好的线性关系，但当浓度偏低时，对总蛋白检测的精确度偏低，不能精确反应出更低浓度的总蛋白的情况。cn106442352a公开了一种抗干扰能力强的血清总蛋白检测试剂盒，由单试剂r组成，试剂r包含3g/l的无水硫酸铜、5g/l的碘化钾、18g/l酒石酸钾钠、8.0g/l的氢氧化钾、0.8％的吐温-20、5g/l的聚氧乙烯月桂醚、6.7g/l的edta·na2、4.6g/l的尿素、0.1％的曲拉通x-100。该专利利用了氢氧化钾取代了氢氧化钠，消除了右旋糖酐对检测结果的干扰；但是其应用灵敏度仍然较差，可测量的浓度较低时，偏差度较高。
鉴于此，开发一种总蛋白检测试剂，使其具有更高精确度是目前亟待解决的困难。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于检测血清总蛋白的试剂及其制备方法。本发明提供的用于检测血清总蛋白的试剂在铜离子用量较低的同时具有较高的检测精度。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于检测血清总蛋白的试剂，所述总蛋白检测试剂包括溶解在水中的如下组分；
本发明特异性的选择添加了壳聚糖和十二烷基硫酸钠，壳聚糖和十二烷基硫酸钠相互作用，协同增效，可以增加硫酸铜与多肽的配位效果，进而增加硫酸铜鉴定总蛋白反应的检测灵敏度，使得本发明提供的用于检测血清总蛋白的试剂可以在硫酸铜含量较低的情况下实现对血清总蛋白的灵敏检测。
壳聚糖和十二烷基硫酸钠的添加量需要在本发明的限定范围内，若任一种的添加量过多，则有可能会完全络合铜离子，反而导致铜离子无法与多肽配位；若任一种的添加量过小，则对硫酸铜和多肽的配位促进效果较差，会导致对总蛋白的检测灵敏度降低。
在本发明中，所述硫酸铜0.5-1.5g/l，例如0.6g/l、0.8g/l、1.0g/l、1.2g/l、1.4g/l等。
在本发明中，所述碱性物质15-20g/l，例如16g/l、17g/l、18g/l、19g/l等。
在本发明中，所述壳聚糖15-20g/l，例如16g/l、17g/l、18g/l、19g/l等。
在本发明中，所述酒石酸钾钠5-10g/l，例如6g/l、7g/l、8g/l、9g/l等。
在本发明中，所述十二烷基硫酸钠1-3g/l，例如1.5g/l、2g/l、2.5g/l等。
在本发明中，所述碱性物质为氢氧化钾和/或氢氧化钠，优选氢氧化钾。
优选地，所述十二烷基硫酸钠的添加量为1-2g/l，例如1.2g/l、1.4g/l、1.5g/l、1.7g/l、1.8g/l、1.9g/l等。
优选地，所述硫酸铜和壳聚糖的质量比为(0.8-1):18，例如0.85:18、0.90:18、0.95:18等。
当壳聚糖和硫酸铜的质量比在上述范围内时，壳聚糖对硫酸铜与多肽配位效果的增强作用最优。
优选地，所述试剂还包括壬基酚聚氧乙烯醚。
优选地，所述壬基酚聚氧乙烯醚和所述壳聚糖的质量比为1:1。
壬基酚聚氧乙烯醚的加入可以增加检测试剂的存储稳定性。
优选地，所述总蛋白检测试剂中，还包括乙二胺四乙酸二钠；
优选地，在所述总蛋白检测试剂中，所述乙二胺四乙酸二钠的浓度为1-3g/l，例如1.5g/l、2g/l、2.5g/l等。
添加乙二胺四乙酸二钠可以避免测试样品中钙离子和镁离子的干扰。
优选地，在所述总蛋白检测试剂中，还包括碘化钾。
优选地，在所述总蛋白检测试剂中，所述碘化钾的浓度为15-20g/l，例如16g/l、17g/l、18g/l、19g/l等。
第二方面，本发明提供了根据第一方面所述的用于检测血清总蛋白的试剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将壳聚糖与十二烷基硫酸钠以及任选的壬基酚聚氧乙烯醚混合，然后与硫酸铜、酒石酸钾钠、任选的碘化钾和部分水混合，得到混合液a；
(2)将碱性物质和另一部分水混合，得到混合液b；
(3)混合液a和混合液b混合，然后加水至目标体积，得到所述用于检测血清总蛋白的试剂。
本发明提供的制备方法先将壳聚糖与十二烷基硫酸钠混合，然后再加入硫酸铜，可以保证壳聚糖、十二烷基硫酸钠与硫酸铜先形成络合物，络合物可溶于水，避免了产生氢氧化铜沉淀，同时络合物并没有完全包裹铜离子，在检测时，铜离子仍然可以与多肽进行配位，进而增加了铜离子与多肽的配位效果。
在制备方法中，水的作用是用来稀释以及定容，因此，本发明对于混合液a和混合液b中含有的水量并不做限定，在制备试剂的过程中，可以在容量瓶中利用水定容。
优选地，所述制备方法还包括，将乙二胺四乙酸二钠加入混合液b中混合。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明特异性的选择添加了壳聚糖和十二烷基硫酸钠，壳聚糖和十二烷基硫酸钠相互作用，协同增效，可以增加硫酸铜与多肽的配位效果，进而增加硫酸铜鉴定总蛋白反应的检测灵敏度，使得本发明提供的用于检测血清总蛋白的试剂可以在硫酸铜含量较低的情况下实现对血清总蛋白的灵敏检测；
(2)本发明提供的制备方法先将壳聚糖与十二烷基硫酸钠混合，然后再加入硫酸铜，可以保证壳聚糖、十二烷基硫酸钠与硫酸铜先形成络合物，络合物可溶于水，避免了产生氢氧化铜沉淀，同时络合物并没有完全包裹铜离子，在检测时，铜离子仍然可以与多肽进行配位，进而增加了铜离子与多肽的配位效果；
(3)本发明提供的用于检测血清总蛋白的试剂对血清总蛋白的检测灵敏度高，对血清总蛋白检测的最低浓度可低至0.01mg/ml；且检测准确度高，在血清总蛋白浓度为0.5mg/ml时，检测准确度在96％以上；同时储存稳定性好，可放置15天后依旧具有较高的检测准确度。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
一种用于检测血清总蛋白的试剂(500ml)，由如下组分组成：硫酸铜1g/l；氢氧化钾18g/l；壳聚糖18g/l；酒石酸钾钠8g/l；十二烷基硫酸钠2g/l；壬基酚聚氧乙烯醚(op-9)18g/l；乙二胺四乙酸二钠2g/l；碘化钾18g/l；余量为水。
制备方法如下：
(1)将配方量的壳聚糖、十二烷基硫酸钠和壬基酚聚氧乙烯醚混合，然后与配方量的硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾和30ml水混合，得到混合液a；
(2)将配方量的氢氧化钾和30ml水混合，得到混合液b；
(3)混合液a和混合液b混合，然后加水至500ml，得到用于检测血清总蛋白的试剂。
实施例2-4
与实施例1的区别在于，硫酸铜的添加量为0.5g/l(实施例2)、0.8g/l(实施例3)、1.5g/l(实施例4)。
实施例5
与实施例1的区别在于，在本实施例中，不添加壬基酚聚氧乙烯醚，用水补齐。
实施例6
一种用于检测血清总蛋白的试剂(500ml)，由如下组分组成：硫酸铜1g/l；氢氧化钠15g/l；壳聚糖20g/l；酒石酸钾钠5g/l；十二烷基硫酸钠1g/l；壬基酚聚氧乙烯醚(op-9)20g/l；乙二胺四乙酸二钠1g/l；碘化钾15g/l；余量为水。
制备方法如下：
(1)将配方量的壳聚糖、十二烷基硫酸钠和壬基酚聚氧乙烯醚混合，然后与配方量的硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾和30ml水混合，得到混合液a；
(2)将配方量的氢氧化钾和30ml水混合，得到混合液b；
(3)混合液a和混合液b混合，然后加水至500ml，得到用于检测血清总蛋白的试剂。
实施例7
一种用于检测血清总蛋白的试剂(500ml)，由如下组分组成：硫酸铜1g/l；氢氧化钾20g/l；壳聚糖15g/l；酒石酸钾钠10g/l；十二烷基硫酸钠3g/l；壬基酚聚氧乙烯醚(op-9)15g/l；乙二胺四乙酸二钠3g/l；碘化钾20g/l；余量为水。
制备方法如下：
(1)将配方量的壳聚糖、十二烷基硫酸钠和壬基酚聚氧乙烯醚混合，然后与配方量的硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾和30ml水混合，得到混合液a；
(2)将配方量的氢氧化钾和30ml水混合，得到混合液b；
(3)混合液a和混合液b混合，然后加水至500ml，得到用于检测血清总蛋白的试剂。
实施例8
与实施例1的区别在于，在本实施例中，不添加壬基酚聚氧乙烯醚、乙二胺四乙酸二钠和碘化钾。
对比例1
与实施例1的区别在于，在本对比例中，不添加壳聚糖，十二烷基硫酸钠的添加量为实施例1中壳聚糖和十二烷基硫酸钠的质量和，即在本对比例中，十二烷基硫酸钠的添加量为20g/l。
对比例2
与实施例1的区别在于，在本对比例中，不添加十二烷基硫酸钠，壳聚糖的添加量为实施例1中壳聚糖和十二烷基硫酸钠的质量和，即在本对比例中壳聚糖的添加量为20g/l。
对比例3
与实施例6的区别在于，本对比例中壳聚糖的添加量为23g/l。
对比例4
与实施例7的区别在于，本对比例中壳聚糖的添加量为12g/l。
对比例5
与实施例6的区别在于，本对比例中十二烷基硫酸钠的添加量为0.1g/l。
对比例6
与实施例7的区别在于，本对比例中十二烷基硫酸钠的添加量为5g/l。
对比例7-8
与实施例1的区别在于，硫酸铜的添加量为0.1g/l(对比例7)、2.0g/l(对比例8)。
对比例9
与实施例1的区别在于，制备方法不同，制备方法如下：
(1)将配方量的硫酸铜、氢氧化钾、壳聚糖、酒石酸钾钠、十二烷基硫酸钠、壬基酚聚氧乙烯醚(op-9)、乙二胺四乙酸二钠2g/l和碘化钾与100ml水混合，使各组分充分溶解，然后加水至500ml，得到用于检测血清总蛋白的试剂。
对比例10
本对比例提供了一种总蛋白定量测试盒(带标准，双缩脲法)，购于上海通蔚实业有限公司，产品货号：twp016898。
性能测试
对实施例1-8和对比例1-10提供的用于检测血清总蛋白的试剂样品进行性能测试，方法如下：
(1)精确度：利用去离子水将血清总蛋白浓度为60mg/ml的样品分别稀释成0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.015mg/ml、0.018mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml。配制上述每个浓度样品18份，利用上述试剂样品对各浓度总蛋白进行检测，记录其可检测的最低浓度，作为评价精确度的标准；
(2)准确度：利用去离子水将浓度为60mg/ml的血清总蛋白稀释成0.5mg/ml，利用上述试剂样品进行检测，记录检测值，并计算测量误差：
测量误差(％)＝|测量值-真实值|/真实值×100％；
其中，“|…|”表示绝对值；
(3)开瓶稳定性测试：将检测试剂样品开瓶放置在2-8℃冷藏箱中(15天不取出)，15天后取出，对血清总蛋白浓度为0.5mg/ml的待检测样进行检测，记录检测值，并计算测量误差；
测试结果见表1：
表1
由实施例和性能测试可知，本发明提供的用于检测血清总蛋白的试剂对血清总蛋白的检测灵敏度高，对血清总蛋白检测的最低浓度可低至0.01mg/ml；且检测准确度高，在血清总蛋白浓度为0.5mg/ml时，检测准确度在96％以上；同时储存稳定性好，可放置15天后依旧具有较高的检测准确度。
由实施例1和实施例2-4的对比可知，硫酸铜和壳聚糖的质量比为(0.8-1):18时，试剂的效果最好；由实施例1和实施例5的对比可知，壬基酚聚氧乙烯醚的加入可以增加检测试剂的存储稳定性；由实施例1和实施例8的对比可知，当试剂中含有壬基酚聚氧乙烯醚、乙二胺四乙酸二钠和碘化钾，检测效果灵敏度较高，存储稳定性较好；由实施例1和对比例1-2的对比可知，壳聚糖和十二烷基硫酸钠具有协同效应，二者共同作用，可增加试剂的检测灵敏度；由实施例6和对比例3、5的对比，实施例7和对比例4、6的对比可知，本发明中的壳聚糖和十二烷基硫酸钠需要在本发明的限定范围内，才能达到本发明的技术效果；由实施例1和对比例7-8的对比可知，本发明中的硫酸铜需要在本发明的限定范围内，才能达到本发明的技术效果。由实施例1和对比例9的对比可知，只有采用本发明的制备方法才能得到本发明的技术效果。由实施例1和对比例10的对比可知，本发明提供的试剂相较于现有技术中的总蛋白检测试剂而言，具有更小的精确度以及更高的测量准确性和存储稳定性。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的用于检测血清总蛋白的试剂及其制备方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。