本发明涉及一种排除干扰的方法，特别涉及一种排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法，属于免疫沉淀技术领域。
背景技术：
巨酶是酶分子通过与血清免疫球蛋白(1型巨酶)结合或通过自身缔合(2型巨酶)导致分子量增加而在血液中循环的酶。血清中常见的巨酶包括巨肌酸激酶(macro-ck)、巨淀粉酶(macro-amy)、巨碱性磷酸酶(macro-alp)、巨天冬氨酸转氨酶(macro-ast)等。由于酶分子与免疫球蛋白的结合，所形成的高分子量化合物不能够通过肾脏清除，半衰期延长，可导致假阳性升高。持续增加的酶含量往往引起疾病的误诊误治，给患者带来沉重的精神负担。最近，我们报道了一例确诊的巨酶病例，该病例在6前年发现血清ast升高，虽然患者没有其它的阳性发现，但6年来一直按照“肝炎”进行治疗。我们通过免疫球蛋白沉淀技术证实是由于巨ast导致的，从而避免了不必要的治疗，消除了患者的心理负担。相关的研究成果发表在了cclm上(clinchemlabmed.2020mar26；58(4):e96-e99.)。
研究报道，巨酶分子可以通过免疫球蛋白电泳、peg沉淀、超滤等方法去除，但这些方法存在很多缺点，比如peg同时会沉淀游离酶，免疫球蛋白电泳费时、成本高，超滤方法特异性差等。在我们报道的病例研究中，采用了商品化的蛋白a、蛋白g吸附血清中的免疫球蛋白，从而去除的巨酶的干扰。但同样由于成本较高，该方法不可能在临床中普及。因此迫切需要一种简单易行、低成本的方法，便于在临床上进行推广。
蛋白a(spa)是几种金黄色葡萄球菌菌株产生的高度稳定的细胞表面受体。它由一条分子量为42kda的多肽链组成，包含四个富含天冬氨酸和谷氨酸但不含半胱氨酸的重复域。它几乎不含碳水化合物，仅含有4个酪氨酸残基，不含色氨酸。蛋白a能够与多种物种(如人、猴子，兔子，猪，豚鼠)的免疫球蛋白(尤其是igg)的fc部分结合。已显示一种蛋白质a分子同时结合至少2个igg分子。蛋白a结合人igg亚类igm，iga和ige的fc部分和小鼠igg1(弱)，igg2a和igg2b分子。我们利用菌体表面高表达蛋白a的金黄色葡萄球菌cowani作为载体，经过对固定和加热灭活等处理步骤，使之与血清中存在的巨酶分子相互作用，通过离心的方法进行分离，从而去除巨酶分子对血清酶检测带来的干扰。该方法简便易行，成本低，适合实验室的推广和普及，因此具有广阔的应用前景。
技术实现要素：
本发明提出了一种排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法，解决了现有技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
本发明提供了一种排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法，所述排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的具体步骤如下：
步骤一：cowani细菌准备
(a1)、为使cowani细菌菌体表面的spa分子更为稳定，首先利用2％福尔马林溶液进行固定，固定时间和条件为室温固定2小时；
(a2)、将固定好的金葡菌放置在80℃水浴中进行灭活，由于spa蛋白对热非常稳定，不会干扰spa的结合活性，同时，灭活后的细菌可以长期保存；
(a3)、采用含有0.5％tween20的pbs溶液进行洗涤，可以去除菌体表面非共价结合的spa蛋白，提高反应的特异性。
步骤二：血清吸附试验
(b1)、抽取怀疑含有巨酶的患者空腹静脉血5ml，待血清自凝后离心，分离血清；
(b2)、将步骤一中的cowani菌液混匀，与血清按照1：1的比例进行混匀，置于37℃摇床(150rpm)孵育3小时，使菌体表面的spa蛋白与免疫球蛋白fc段充分结合成免疫复合物；
(b3)、通过高速离心的方式对免疫复合物进行分离，吸取上层分离血清进行酶浓度检测。
步骤三：吸附前后血清酶浓度检测和结果计算
(c1)、通过标准方法检测血清吸附前后的酶浓度；
(c2)、吸附后酶浓度校正：在酶和免疫球蛋白检测时，将吸附后检测到的浓度水平乘以稀释倍数，得到的数值与原始浓度的比值，即为回收率，相应的吸附率(％)计算方式为：100％-回收率％。
(c3)、比较吸附前后血清酶的水平，以及回收率和吸附率，判断是否存在巨酶干扰现象；如吸附后酶水平处于正常参考区间，可以判断存在巨酶干扰，对检测报告进行结果更正。
作为本发明的一种优选技术方案，所利用的cowani菌株是高表达膜表面spa的金黄色葡萄球菌。
作为本发明的一种优选技术方案，对cowani金黄色葡萄球菌进行处理时，首先利用2％福尔马林溶液先行细胞固定；然后经洗涤后用80℃的水浴5分钟进行灭活。
作为本发明的一种优选技术方案，本发明的方法适用于排除巨天冬氨酸酰基转移酶(macro-ast)、巨肌酸激酶(macro-ck)、巨淀粉酶(macro-amy)和巨碱性磷酸酶(macro-alp)造成的干扰。
本发明所达到的有益效果是：本发明的一种排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法与现有技术相比，具有以下的有益效果：
1、本发明的排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法利用金黄色葡萄球菌表面的spa与免疫球蛋白fc段特异性结合的特性，可以去除“巨酶”对血清酶检测带来的干扰，对游离酶分子没有影响，同时，实验室只需要培养高表达spa的cowani金葡菌，经过固定-洗涤-加热灭活几个步骤，可在4℃保存半年以上。
2、本发明的排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法与凝胶电泳、超滤、spa琼脂糖凝胶颗粒吸附等方法比较起来，具有简便易行、经济快速、特异性强等特点，非常适合在临床上进行推广。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明提供了一种排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法，利用cowani金黄色葡萄球菌吸附血清中的“巨ast”，以排除其对血清游离ast检测的干扰，更为具体的步骤为：
步骤一：cowani细菌准备
(a1)、将cowani接种于200mllb液体培养基中，置于37℃摇床培养过夜；
(a2)、第二天将菌液离心(5000rpm，10分钟)，收集细菌，pbs溶液洗涤2次；
(a3)细菌固定：将洗涤后的cowani金葡菌加入到含有1.5％福尔马林溶液，混匀，室温下固定2小时；
(a4)洗涤：pbs溶液洗涤，以去除溶液中的福尔马林，然后利用pbs配制成50％浓度的菌液；
(a5)灭活：将菌液倒入锥形瓶内(少于1.5cm高度)，置于80℃水浴，水平摇动5min；
(a6)、冰浴：将锥形瓶立即放置在冰上进行降温；
(a7)、洗涤：首先用含有0.5％tween20的pbs溶液洗涤一次，再用不含tween20的pbs洗涤；
(a8)、保存：洗涤后的菌液保存于4℃冰箱，用前需摇匀。(可保存半年)
步骤二：血清吸附试验
(b1)、血清准备：抽取怀疑含有巨ast的患者空腹静脉血5ml，待血清自凝后离心，分离血清；
(b2)、将步骤一中的cowani菌液混匀，吸取500ul加入到ep管内，室温静置30分钟复温，然后加入患者血清500ul，混匀；
(b3)、置于37℃摇床(150rpm)孵育3小时；
(b4)、离心：将上述ep管置于离心机中离心10分钟，转速为10000rpm，小心吸取上层血清500ul，加入到新的ep管，待测ig和ast浓度。
步骤三：血清ast和免疫球蛋白浓度检测：
(c1)、利用西门子bnprospec免疫比浊仪检测免疫球蛋白(igm、igg、iga)浓度；
(c2)利用rochecobasc701检测cowani吸附前后的ast浓度；
其中，检测试剂均为仪器配套试剂，按照标准操作规程进行。
步骤四：结果计算
(d1)、吸附后酶浓度校正：在酶和免疫球蛋白检测时，因血清与cowani菌液按1：1进行混合，故将吸附后检测到的浓度水平乘以稀释倍数(此处为2)，得到的数值与原始浓度的比值，即为回收率，相应的吸附率计算方式为：100％-回收率％。
(d2)、结果：
表1.cowani吸附前后血清免疫球蛋白和ast回收率
其中，ig浓度单位为g/l，ast浓度单位为u/l。
由表1结果显示：cowani对igg吸附作用最强，巨ast和对照组吸附率分别为34.48％和41.92％，igm吸附率低于igg，分别为17.74％和12.7％。巨ast血清原始ast为109u/l，吸附后的换算浓度为22.2％，吸附率为79.63％，而对于对照血清，吸附前后的ast值分别为161u/l和156.8u/l，吸附率仅为2.61％。由此可见，巨ast组存在巨酶干扰现象，导致血清中ast的实测值明显增高，考虑到cowani细菌吸附免疫球蛋白并不能达到100％，实际血清中的ast浓度应小于22.2u/l，可按<22.2u/l进行结果报告，介于正常参考区间。
本发明的排除巨酶分子对血清酶浓度检测带来干扰的方法利用金黄色葡萄球菌表面的spa与免疫球蛋白fc段特异性结合的特性，可以去除“巨酶”对血清酶检测带来的干扰，对游离酶分子没有影响，同时，实验室只需要培养高表达spa的cowani金葡菌，经过固定-洗涤-加热灭活几个步骤，可在4℃保存半年以上；与凝胶电泳、超滤、spa琼脂糖凝胶颗粒吸附等方法比较起来，具有简便易行、经济快速、特异性强等特点，非常适合在临床上进行推广。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。