一种用于流感和COVID-19联合检测的试纸条及其应用的制作方法

本发明属于生物检测
技术领域：
，涉及一种用于流感和covid-19联合检测的试纸条及其应用。
背景技术：
：新型冠状病毒(covid-19)正在严重危及中国乃至全球人类的生命以及财产安全。该疾病一般呈现3-7天的潜伏期，有些患者出现更长的潜伏期，患者在潜伏期无明显症状，但是具有传染性，病情一旦发展，致死率高，所以早期筛查和快速诊断意义重大。目前临床必须结合核酸诊断和ct扫描，才能实现确诊，但核酸诊断试剂盒检测阳性率低，而且核酸检测对实验环境要求较高，普通医院实验室以及基层卫生防疫检疫机构无法达到该要求，检测时间长，限制了其广泛应用。同样，流感病毒也是一种急性传染病，其主要病源体是流感病毒a型和b型，在具有潜在病理学患者中会产生并发症，多次引起世界大流行，严重者可导致死亡。由于流感病毒症状与新型冠状病毒症状在临床上均有发热、咳嗽、呼吸困难，引起肺炎等相似症状，在临床上有时无法区别。因此，开发出一次性检测且能区分流感病毒和新型冠状病毒感染尤其重要。根据目前的文献和专利，尚未发现三者联合检测的试剂盒与技术方法。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于流感和covid-19联合检测的试纸条及其应用。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：1、一种用于流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体联合检测的试纸条，包括pvc底板，在pvc底板上依次贴覆样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，结合垫上喷有胶体金标记的抗人igm抗体和胶体金标记的抗鸡igy；硝酸纤维素膜依次包被有3条检测线和1条质控线，所述的3条检测线分别为流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原，所述的1条质控线为抗体鸡igy。优选的，所述结合垫为玻璃纤维膜。2、一种用于流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体联合检测的试剂盒，是由样本稀释液与试纸卡组成的，其中，试纸卡包括卡壳和上述试纸条，卡壳由上盖和下盖组成，在上盖靠近样品垫的一端开设有加样孔。上述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：1)样本稀释液制备：所述样本稀释液所采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液ph6.0-8.0或生理盐水，包含0.01-1％的表面活性剂吐温20或tritonx-100。2)样品垫的处理①所述样品垫处理液中含有0.1-0.7％的酪蛋白钠盐，0.05-1％tween20，2-4％蔗糖，0.1-0.5％红细胞腹水(购自厦门波生生物科技有限公司，用于阻断红细胞)，含0.01-0.1％鼠igg与兔igg作为阻断剂，采用20mmtris-clph8.5-9.0的缓冲液溶解。②将玻璃纤维素膜采用样品垫处理浸泡，37℃干燥12-24小时。3)胶体金结合垫制备：①所述结合垫处理液所采用的缓冲液为碱性缓冲液ph8.0-9.0，如硼酸盐缓冲液和tris-cl缓冲液等，包含有0.1-2％牛血清白蛋白，2-5％的海藻糖，0.01-1％的表面活性剂tween20或tritonx-100，0.1-0.5％酪蛋白钠盐。②将玻璃纤维素膜采用结合垫处理液浸泡，37℃干燥12-24小时。③再将胶体金标记结合物按一定比例进行混合(胶体金标记的抗人igm抗体和胶体金标记的抗鸡igy按照体积比4：1混合)，喷制在处理好的结合垫上。④将喷有胶体金标记物的结合垫37℃干燥12-24小时。4)nc膜包被液制备：所述样品垫处理液所采用的缓冲液为碱磷酸盐缓冲液ph7.2-7.5，包含有0.01-1％牛血清白蛋白，1-5％的海藻糖或蔗糖。5)nc膜制备：将nc膜贴上pvc板上，37℃干燥12-24小时。6)裁切：将制备好的样品垫、胶体金结合垫、吸水纸进行裁切，按次序贴在有nc膜的pvc板上，再裁切成宽为3±1mm的试纸条。7)装卡：将裁切好的试纸条装入卡壳中，组成检测试纸卡。8)组装：将组装好的试纸卡连同干燥剂用铝箔袋密封装置，室温保存。3、上述试纸条或试剂盒在作为流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体联合检测试剂中的应用。4、利用上述试剂盒实现的一种流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体联合检测方法，采用间接法，先将待测样本滴入加样孔中，再加入样本稀释液得到样本，样本中流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体与结合垫上的胶体金标记的抗人igm抗体结合，在层析作用下，再与硝酸纤维素膜上流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原结合，通过颜色的有无判断是否含有流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体。优选的，所述待测样本选自血清、血浆、全血或末梢血中的任一种。5、一种用于流感病毒抗体和covid-19抗体联合检测的试纸条，包括pvc底板，在pvc底板上依次贴覆样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，结合垫上喷有胶体金标记的流感病毒融合抗原和covid-19抗原和胶体金标记的抗鸡igy；硝酸纤维素膜依次包被有2条检测线和1条质控线，所述的2条检测线分别为流感病毒融合抗原和covid-19抗原，所述的1条质控线为抗体鸡igy。优选的，所述结合垫为玻璃纤维膜。6、一种用于流感病毒抗体和covid-19抗体联合检测的试剂盒，是由样本稀释液与试纸卡组成的，其中，试纸卡包括卡壳和上述试纸条，卡壳由上盖和下盖组成，在上盖靠近样品垫的一端开设有加样孔。7、上述试纸条或试剂盒在作为流感病毒抗体和covid-19抗体联合检测试剂中的应用。8、利用上述试剂盒实现的一种流感病毒抗体和covid-19抗体联合检测方法，采用双抗原夹心法，先将待测样本滴入加样孔中，再加入样本稀释液得到样本，样本中流感病毒抗体和covid-19抗体与结合垫上的胶体金标记的流感病毒融合抗原和covid-19抗原结合，在层析作用下，再与硝酸纤维素膜上流感病毒抗原和covid-19抗原结合，形成夹心结构，通过颜色的有无判断是否含有流感病毒抗体和covid-19抗体。优选的，所述待测样本选自血清、血浆、全血或末梢血中的任一种。9、一种用于流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原联合检测的试纸条，包括pvc底板，在pvc底板上依次贴覆样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，其中，结合垫上喷有胶体金标记的链霉亲和素和胶体金标记的抗鸡igy；硝酸纤维素膜依次包被有3条检测线和1条质控线，所述的3条检测线分别为流感病毒a型单克隆抗体、流感病毒b型单克隆抗体和covid-19单克隆抗体，所述的1条质控线为抗体鸡igy。优选的，所述结合垫为玻璃纤维膜。10、一种用于流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原联合检测的试剂盒，是由样本稀释液与试纸卡组成的，其中，试纸卡包括卡壳和上述试纸条，卡壳由上盖和下盖组成，在上盖靠近样品垫的一端开设有加样孔。上述试剂盒的制备方法，具体步骤如下：1)样本稀释液制备：①所述样本稀释液所采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液ph6.0-8.0，包含0.01-1％的表面活性剂吐温20或tritonx-100、0.05-0.5％酪蛋白钠盐、2-5％海藻糖或蔗糖、0.005-0.2％sds、0.1-2％bsa和含有proclin300的防腐剂溶液。②在上述溶液再加入一定体积的流感病毒a型生物素化的抗体、流感病毒b型生物素化的抗体和covid-19生物素化抗体。2)样品垫的处理①所述样品垫处理液中含有0.05-0.3％的酪蛋白钠盐，0.05-1％tween20，2-4％蔗糖，采用20mmtris-clph8.5-9.0的缓冲液溶解。②将玻璃纤维素膜采用样品垫处理浸泡，37℃干燥12-24小时。3)胶体金结合垫制备：①所述结合垫处理液所采用的缓冲液为碱性缓冲液ph8.0-9.0，如硼酸盐缓冲液和tris-cl缓冲液等，包含有0.1-2％牛血清白蛋白，2-5％的海藻糖，0.01-1％的表面活性剂tween20或tritonx-100，0.1-0.5％酪蛋白钠盐。②将玻璃纤维素膜采用结合垫处理液浸泡，37℃干燥12-24小时。③再将胶体金标记结合物按一定比例进行混合(胶体金标记的链霉亲和素和胶体金标记的抗鸡igy按照体积比4：1混合)，喷制在处理好的结合垫上。④将喷有胶体金标记物的结合垫37℃干燥12-24小时。4)nc膜包被液制备：所述样品垫处理液所采用的缓冲液为碱磷酸盐缓冲液ph7.2-7.5，包含有0.01-1％牛血清白蛋白，1-5％的海藻糖或蔗糖。5)nc膜制备：将nc膜贴上pvc板上，按图3所示依次划线，37℃干燥12-24小时。6)裁切：将制备好的样品垫、胶体金结合垫、吸水纸进行裁切，按次序贴在有nc膜的pvc板上，再裁切成宽为3±1mm的试纸条。7)装卡：将裁切好的试纸条装入卡壳中，组成检测试纸卡。8)组装：将组装好的试纸卡连同干燥剂用铝箔袋密封装置，室温保存。11、上述试纸条或试剂盒在作为流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原联合检测试剂中的应用。12、利用上述试剂盒实现的一种流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原联合检测方法，采用双抗体夹心法，先将待测样本与样本稀释液混匀制成样本，再将样本滴入加样孔中，样本中流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原与样本稀释液中相应的生物素化抗体结合，再与结合垫上的胶体金标记的链霉亲和素结合，在层析作用下，再与硝酸纤维素膜上流感病毒a型单克隆抗体、流感病毒b型单克隆抗体和covid-19单克隆抗体结合，形成夹心结构，通过颜色的有无判断是否含有流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原。优选的，所述待测样本为鼻咽拭子。本发明所涉及的百分数，固体对应的是质量百分比，液体对应的是体积百分比。本发明涉及的所有抗体、抗原均购自深圳市艾伟迪生物科技有限公司。本发明的有益效果在于：本发明采用胶体金免疫层析法，通过一次性检测，区分了流感病毒感染和covid-19病毒感染，节约了成本，提高了工作效率，特别是三者抗原检测，采用生物素与亲和素的放大系统，提高了检测灵敏度，为临床鉴别诊断提供了重要依据。具体实现了以下三种检测：1、将流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和新型冠状病毒igm抗体联合检测。2、将流感病毒抗体和新型冠状病毒抗体联合检测。3、流感病毒a型抗原、b型抗原和新型冠状病毒抗原联合检测。附图说明为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：图1为一种用于流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体联合检测的试剂盒；其中，t1线：流感病毒a型igm抗体；t2线：流感病毒b型igm抗体；t3线：covid-19igm抗体。图2为一种用于流感病毒抗体和covid-19抗体联合检测的试剂盒；其中，t1线：流感病毒融合抗原；t2线：covid-19抗原。图3为一种用于流感病毒a型抗原、流感病毒b型抗原和covid-19抗原联合检测的试剂盒；其中，t1线：流感病毒a型单克隆抗体；t2线：流感病毒b型单克隆抗体；t3线：covid-19单克隆抗体。具体实施方式下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例1：流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和covid-19igm抗体联合检测试剂盒的制备：1)样本稀释液制备：所述样本稀释液所采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液ph7.2，包含0.1％的表面活性剂吐温20。2)样品垫的处理①所述样品垫处理液中含有0.5％的酪蛋白钠盐，0.5％tween20，2％蔗糖，0.2％红细胞腹水，含0.08％鼠igg与兔igg作为阻断剂，采用20mmtris-clph8.7的缓冲液溶解。②将玻璃纤维素膜采用样品垫处理浸泡，37℃干燥20小时。3)胶体金结合垫制备：①所述结合垫处理液所采用的缓冲液为碱性缓冲液ph8.5，如硼酸盐缓冲液和tris-cl缓冲液等，包含有1％牛血清白蛋白，5％的海藻糖，0.5％的表面活性剂tween20，0.3％酪蛋白钠盐。②将玻璃纤维素膜采用结合垫处理液浸泡，37℃干燥20小时。③再将胶体金标记结合物按一定比例进行混合，喷制在处理好的结合垫上。④将喷有胶体金标记物的结合垫37℃干燥22小时。4)nc膜包被液制备：所述样品垫处理液所采用的缓冲液为碱磷酸盐缓冲液ph7.4，包含有0.1％牛血清白蛋白，3％的海藻糖或蔗糖。5)nc膜制备：将nc膜贴上pvc板上，按图1所示依次划线，37℃干燥20小时。6)裁切：将制备好的样品垫、胶体金结合垫、吸水纸进行裁切，按次序贴在有nc膜的pvc板上，再裁切成宽为3mm的试纸条。7)装卡：将裁切好的试纸条装入卡壳中，组成检测试纸卡。8)组装：将组装好的试纸卡连同干燥剂用铝箔袋密封装置，室温保存。检测方法：1、样本类型：检测样本为血清、血浆、全血和末稍血。2、检测方法：①取10μl样本加入加样孔中；②再取100μl样本稀释液加入加样孔中；③反应10分钟后，通过颜色的有无判断是否有流感病毒和covid-19的存在。性能检测：1、将流感病毒a型igm抗体、流感病毒b型igm抗体和新型冠状病毒igm抗体联合检测。①临床样本检测，结果见表1。表1.实施例1临床样本检测结果②稳定性检测将试剂盒放置55℃7天、14天、28天进行比较，检测结果与上述一致。③灵敏度检测将1例igm阳性的流感病毒a型的样本、1例igm阳性的流感病毒b型的样本和1例igm阳性的covid-19的样本，采用样本稀释液按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64进行稀释，检测结果见表2。表2.实施例1灵敏度检测结果样本1：21：41：81：161：321：64本发明试剂流感a型igm结果+++++—商品化试剂流感a型igm结果+++———本发明试剂流感b型igm结果++++——商品化试剂流感b型igm结果+++———本发明试剂covid-19igm结果+++++—商品化试剂covid-19igm结果+++———④特异性检测选取乙肝表面抗原阳性5例，丙肝抗体阳性5例，梅毒抗体阳性5例，类风湿患者样本2例，高胆固醇5例，高胆红素5例，高血红蛋白3例进行检测，检测结果均为阴性，具体见表3。表明，本试剂检测特异性良好。表3.实施例1特异性检测结果根据以上结果，本试剂盒的检测灵敏度和特异与商品化试剂相比有明显提高，适用于临床的感染筛查与辅助诊断。实施例2：流感病毒抗体和新型冠状病毒抗体联合检测参考图2，试剂盒的制备与检测方法同实施例1。①临床样本检测，结果见表4。表4.实施例2临床样本检测结果②稳定性检测将试剂盒放置55℃7天、14天、28天进行比较，检测结果与上述一致。③灵敏度检测将1例的流感病毒a型抗体阳性样本、1例流感病毒b型抗体阳性样本、1例副流感病毒抗体阳性样本和1例covid-19抗体阳性样本，采用样本稀释液按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64进行稀释，检测结果见表5。表5.实施例2灵敏度检测结果样本1：21：41：81：161：321：64本发明试剂流感a型抗体结果+++++—商品化试剂流感a型抗体结果+++———本发明试剂流感b型抗体结果++++——商品化试剂流感b型抗体结果+++———本发明试剂副流感抗体结果++++——商品化试剂副流感抗体结果+++———本发明试剂covid-19抗体结果+++++—商品化试剂covid-19抗体结果+++———④特异性检测选取乙肝表面抗原阳性5例，丙肝抗体阳性5例，梅毒抗体阳性5例，类风湿患者样本2例，高胆固醇5例，高胆红素5例，高血红蛋白3例进行检测，检测结果均为阴性，具体见表6。表明，本试剂检测特异性良好。表6.实施例2特异性检测结果根据以上结果，本试剂盒的检测灵敏度和特异与商品化试剂相比有明显提高，适用于临床的感染筛查与辅助诊断。实施例3：流感病毒a型抗原、b型抗原和新型冠状病毒抗原联合检测1)样本稀释液制备：①所述样本稀释液所采用的缓冲液为磷酸盐缓冲液ph7.2，包含0.1％的表面活性剂吐温20、0.2％酪蛋白钠盐、4％海藻糖或蔗糖、0.1％sds、1％bsa和含有proclin300的防腐剂溶液。②在上述溶液再加入一定体积的流感病毒a型生物素化的抗体、流感病毒b型生物素化的抗体和covid-19生物素化抗体。2)样品垫的处理①所述样品垫处理液中含有0.2％的酪蛋白钠盐，0.5％tween20，2％蔗糖，，采用20mmtris-clph8.7的缓冲液溶解。②将玻璃纤维素膜采用样品垫处理浸泡，37℃干燥18小时。3)胶体金结合垫制备：①所述结合垫处理液所采用的缓冲液为碱性缓冲液ph8.5，如硼酸盐缓冲液和tris-cl缓冲液等，包含有1％牛血清白蛋白，5％的海藻糖，0.1％的tween20，0.2％酪蛋白钠盐。②将玻璃纤维素膜采用结合垫处理液浸泡，37℃干燥20小时。③再将胶体金标记结合物按一定比例进行混合，喷制在处理好的结合垫上。④将喷有胶体金标记物的结合垫37℃干燥20小时。4)nc膜包被液制备：所述样品垫处理液所采用的缓冲液为碱磷酸盐缓冲液ph7.2，包含有0.1％牛血清白蛋白，3％的海藻糖或蔗糖。5)nc膜制备：将nc膜贴上pvc板上，按图3所示依次划线，37℃干燥20小时。6)裁切：将制备好的样品垫、胶体金结合垫、吸水纸进行裁切，按次序贴在有nc膜的pvc板上，再裁切成宽为3mm的试纸条。7)装卡：将裁切好的试纸条装入卡壳中，组成检测试纸卡。8)组装：将组装好的试纸卡连同干燥剂用铝箔袋密封装置，室温保存。检测方法：1、样本类型：检测样本为鼻咽拭子。2、检测方法：①将所取的鼻咽拭子与200-1000μl的样本稀释液混匀；②再取100μl样本稀释液加入加样孔中；③反应10分钟后，通过颜色的有无判断是否有流感病毒和covid-19的存在。性能检测：①临床样本检测，结果见表7。表7.实施例3临床样本检测结果②稳定性检测将试剂盒放置55℃7天、14天、28天进行比较，检测结果与上述一致。③灵敏度检测将1例的流感病毒a型抗原阳性样本、1例流感病毒b型抗原阳性样本和1例covid-19抗原阳性样本，采用样本稀释液按1：2、1：4、1：8、1：16、1：32进行稀释，检测结果见表8。表8.实施例3灵敏度检测结果样本1：21：41：81：161：32本发明试剂流感a型抗原结果++++—商品化试剂流感a型抗原结果++———本发明试剂流感b型抗原结果+++——商品化试剂流感b型抗原结果++———本发明试剂covid-19抗原结果++++—④特异性检测选取乙肝表面抗原阳性5例，丙肝抗体阳性5例，梅毒抗体阳性5例，类风湿患者样本2例，高胆固醇5例，高胆红素5例，高血红蛋白3例进行检测，检测结果均为阴性，具体见表9。表明，本试剂检测特异性良好。表9.实施例3特异性检测结果根据以上结果，本试剂盒的流感病毒a型抗原与流感病毒b型抗原子检测灵敏度和特异与商品化试剂相比有明显提高。由于covid-19目前没有商品化的抗原检测试剂，所以未进行对比检测，但从试验结果看，表现出了良好的特异性和灵敏，综合以上，本发明试剂适用于临床的感染筛查与辅助诊断。最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。当前第1页12