即用型维生素标准品及其制备方法、使用方法和贮存稳定剂与流程

本发明属于维生素标准品制备
技术领域：
，具体涉及一种即用型维生素标准品及其制备方法、使用方法和贮存稳定剂。
背景技术：
：标准品被用以校准测量装置、评价测量方法或赋值的一种材料或物质。市面上大部分高纯度的标准品商品规格小且价格昂贵，粉末状标准物质容易分散在瓶壁和盖子上，多次开瓶使用易造成吸潮成团，而液体状标准物质会吸附在瓶壁形成一层肉眼难辨的液层，导致称取过程损失而造成浪费。维生素标准溶液配制浓度低，需用高精确度天平称量，称取量少，损失量大。当标准品用于化学分析仪器的定度时，化学分析仪的检测原理为相对测量法，检测时需制备标准曲线来分析定量，因此标准品亦被称为分析测量行业的“量具”。大部分维生素项目检测为ng/ml量级，低浓度的维生素标准溶液保存不稳定，国标中要求维生素标准工作液需现配现用。目前，真空冷冻干燥技术已广泛应用于血清、血浆、疫苗、酶、抗生素、激素等药品及食品的生产，使干燥后的产品能长期保存而不变质。但大多数冻干产品在保存期间易吸潮变质、产品外观不佳、复水性差等问题。中国专利cn201910188685、cn201710001500以及美国专利us8357504b2中提供的标准品制备方法在一定程度上解决了维生素标准曲线繁琐的配制过程，但其仍存在如下明显的问题：1）干燥标准品非无菌，使用前需要过滤；2）干燥标准品浓度较高，需再进一步逐个浓度稀释备用；3）干燥标准品保存期较短。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供了一种高稳定性的即用型维生素标准品及其制备方法、使用方法和贮存稳定剂，本发明即用型维生素标准品的制备方法，不仅提高低浓度标准物质长期储存的稳定性，而且制备得到的维生素标准品使用操作复水即溶，省去标准溶液繁琐的配制过程。本发明制备方法克服了现有粉末状及液态维生素标准物质配制过程繁琐、称量过程易损失、贮存过程易降解等技术问题，本发明维生素标准品包含标准曲线制备所需的系列梯度浓度维生素标准物质和贮存稳定剂，能够低温条件下的长期稳定贮存（≤8℃，1年），适用于维生素b12、生物素、叶酸、泛酸、维生素b1、维生素b2、维生素b6、尼克酸等维生素。本发明的上述目的是通过以下技术方案予以实现的：一种即用型维生素标准品的制备方法，其包括以下步骤：（1）使用贮存稳定剂稀释维生素标准储备液得维生素标准工作液；（2）对维生素标准工作液进行除菌及标准物质浓度符合性验证；（3）采用真空冷冻干燥技术将所需浓度的维生素标准混合液固定于容器中；所需浓度的维生素标准混合液是指使用贮存稳定剂将步骤（2）的维生素标准工作液稀释至系列梯度浓度标准溶液；（4）包装、贮存。作为本发明提供的所述的即用型维生素标准品的制备方法的一种实施方式，所述贮存稳定剂由以下组份组成：2~10wt%甘露醇、0.5~2wt%葡聚糖、0.2~1wt%聚乙烯吡咯烷酮、2~4wt%海藻糖，2~4wt%聚乙二醇、0.02~0.05m磷酸氢二钠、1~5mm磷酸二氢钠、0.05-0.2wt%聚山梨酯，余量为水。所述贮存稳定剂使用前进行高温灭菌备用。优选地，上述高温灭菌是指通过高压灭菌锅与121℃±3℃下灭菌5~15min。作为本发明提供的所述的即用型维生素标准品的制备方法的一种实施方式，步骤（1）具体是使用贮存稳定剂稀释维生素标准储备液得维生素工作液，至少需经过103倍的稀释。确保维生素标准溶液介质含足够含量的贮存稳定剂以及确保后续进一步的梯度稀释标准溶液介质的均一性，从而得到一致的冻干保护稳定作用。作为本发明提供的所述的即用型维生素标准品的制备方法的一种实施方式，步骤（2）所述的对维生素标准工作液进行除菌及标准物质浓度符合性验证是指使用0.22μm~0.45μm滤膜进行过滤除菌，再结合已知浓度的维生素质控样品对维生素标准工作液进行符合性验证。作为本发明提供的所述的即用型维生素标准品的制备方法的一种实施方式，步骤（3）所述的维生素标准混合液固定是指根据实验方法所需的浓度与体积，使用贮存稳定剂将步骤（2）维生素标准工作液稀释至系列梯度浓度标准溶液得系列梯度浓度维生素标准混合液，然后将系列梯度浓度维生素标准混合液分装入容器中以浸满容器底部的一周，采用真空冷冻干燥技术进行20~40h冻干，将标准溶液固定于容器中。作为本发明提供的所述的即用型维生素标准品的制备方法的一种实施方式，所述维生素标准混合液在容器中的液面高度≤10mm。作为本发明提供的所述的即用型维生素标准品的制备方法的一种实施方式，步骤（4）所述的包装是指保证标准品维持在无菌、遮光、干燥条件下，并置于≤8℃贮存。一种即用型维生素标准品，其通过任一上述即用型维生素标准品的制备方法制备获得。一种上述的即用型维生素标准品的使用方法，是指往冻干有维生素标准混合液的容器中加入无菌水，混匀后即可即获得标准曲线系列梯度溶液。一种即用型维生素标准品用的贮存稳定剂，其由以下组份组成：2~10wt%甘露醇、0.5~2wt%葡聚糖、0.2~1wt%聚乙烯吡咯烷酮、2~4wt%海藻糖，2~4wt%聚乙二醇、0.02~0.05m磷酸氢二钠、1~5mm磷酸二氢钠、0.05-0.2wt%聚山梨酯，余量为水。与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明提供的高稳定性的即用型维生素标准品的制备方法，其精准痕量固定维生素标准物质，可作为分析检测维生素时内标法与外标法的直接使用标准品。本发明可根据检测方法需求固定于多种容器载体中，因维生素标准溶液与贮存稳定剂混合冻干后，结构坚固、无飞粉，不易吸潮、塌陷，该容器载体可以是有盖密封，也可以是无盖密封容器，冻干物料复水易溶解，经长期低温保存（≤8℃，1年）损失率≤5%，并且在短期高温储存条件下损失率≤5%（≤60℃，7天），可避免运输途中高温条件造成维生素标准品的降解。本发明提供的高稳定性的即用型维生素标准品的制备方法，解决了现有的标准品使用过程配制繁琐、贮存不稳定的问题，属于维生素标准品的
技术领域：
。本发明的即用型标准品兼具稳定性高和复水性佳的优点，满足低温条件下的长期稳定贮存（≤8℃，1年），可实现大批量标准曲线溶液精准地固定化，且批次内差异小，减少实验前准备，提高检测效率。本发明提供的高稳定性的即用型维生素标准品使用时，仅需‘加水→吹打/涡旋混匀’即可完成标准曲线溶液的配制，省略标准物质的称量、定容、定值、除菌等制备过程。附图说明为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本发明中板条式即用型维生素b12标准品示意图，图中，11-微孔板条，12-维生素b12标准品；图2为本发明瓶装即用型生物素标准品示意图，图中，21-瓶装容器，22-生物素标准品。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。本发明所述实施例使用的材料的和试剂等，均为市购。下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。实施例1.即用型的维生素b12板条式标准品维生素b12在食物中含量甚微，一般在2-10μg/100g范围内，国标中利用atcc7830对维生素b12的特异性和高敏感性进行定量测定，该方法的灵敏度达到0.001ng/ml，所需维生素b12标准品亦是较低的浓度。本实施例所述的维生素b12粉末标准物质购自supelco47869，纯度99.2%。一种高稳定性的即用型维生素b12板条式标准品的制备方法，其通过以下步骤制备得到：（10）配制维生素b12标准储备液和配制贮存稳定剂；（11）使用上述步骤（10）配制的贮存稳定剂充分混合稀释上述步骤（10）配制的维生素b12标准储备液得维生素b12标准工作液；（12）对维生素b12标准工作液进行除菌及浓度符合性验证；（13）采用真空冷冻干燥技术将所需浓度的维生素b12标准混合液固定于容器中，如图1所示；所需浓度的维生素b12标准混合液是指使用贮存稳定剂将步骤（12）的维生素b12标准工作液稀释至系列梯度浓度标准溶液；（14）包装、贮存。其中，步骤（10）所述的维生素b12标准储备液是指精确称取维生素b12粉末标准品，用25%乙醇溶液定容至10μg/ml，获得维生素b12标准储备液。其中，步骤（10）所述的贮存稳定剂由以下组份组成：2wt%甘露醇、0.5wt%葡聚糖、0.5wt%聚乙烯吡咯烷酮、2wt%海藻糖、2wt%聚乙二醇、0.02m磷酸氢二钠、1mm磷酸二氢钠、0.1wt%聚山梨酯，余量为水，该贮存稳定剂通过高压灭菌锅121℃灭菌15min备用。其中，步骤（11）所述的维生素b12标准工作液是指使用贮存稳定剂稀释维生素b12标准储备液10μg/ml至工作液浓度0.6ng/ml；其中，步骤（12）所述的对维生素标准工作液进行除菌及浓度符合性验证是指使用0.22μm滤膜对0.6ng/ml维生素b12标准工作液进行过滤除菌，再结合已知浓度的维生素质控样品（no：4044755861，质控范围：2.12~2.88μg/100g）对维生素标准工作液进行浓度符合性验证。其中，步骤（13）根据维生素b12检测试剂盒实验方法中所需标准溶液体积为150μl，所需生物素标准曲线浓度为0、0.0075、0.015、0.03、0.045、0.06、0.09ng/ml，用贮存稳定剂对步骤（12）的标准工作液进一步系列梯度浓度标准溶液稀释0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6ng/ml，由低浓度至高浓度，移取48μl有秩序地分装入板条的每个微孔中能浸满微孔底部的一周且液面高度≤10mm，利用真空冷冻干燥技术进行冻干20h，将一系列维生素b12标准混合液真空冷冻干燥固定化于微孔中。其中，步骤（14）所述的包装、贮存是指将已固定维生素b12标准物质的微孔置于相应定制规格的铝箔袋中，进行抽真空并密封置于≤8℃环境保存。本实施例制得的维生素b12标准品使用时，每个微孔中加入320μl无菌水，吹打均匀，移取150μl标准溶液入微孔板孔中，即可完成维生素b12标准曲线溶液的制备。实施例2.即用型的生物素瓶装标准品本实施例所述的生物素粉末标准物质购自supelco47868，纯度98%。一种高稳定性的即用型生物素瓶装标准品的制备方法，其通过以下步骤制备得到：（20）配制生物素标准储备液和配制贮存稳定剂；（21）使用上述步骤（20）配制的贮存稳定剂充分混合稀上述步骤（20）配制的生物素标准储备液得生物素标准工作液；（22）对生物素标准工作液进行除菌及浓度符合性验证；（23）采用真空冷冻干燥技术将所需浓度的生物素标准混合液固定于容器中，如图2所示；所需浓度的生物素标准混合液是指使用贮存稳定剂将步骤（2）的生物素标准工作液稀释至系列梯度浓度标准溶液；（24）包装、贮存。其中，步骤（20）所述的生物素标准储备液是指精确称取生物素粉末标准品，用50%乙醇溶液定容至100μg/ml，获得生物素标准储备液。其中，步骤（20）所述的贮存稳定剂由以下组份组成：2wt%甘露醇、1wt%葡聚糖、0.4wt%聚乙烯吡咯烷酮、4wt%海藻糖、1wt%聚乙二醇、0.04m磷酸氢二钠、1mm磷酸二氢钠、0.1wt%聚山梨酯，余量为水，所述贮存稳定剂通过高压灭菌锅121℃灭菌15min备用。其中，步骤（21）所述的生物素标准工作液是指使用贮存稳定剂稀释生物素标准储备液至工作液浓度5ng/ml。其中，步骤（22）所述的对生物素标准工作液进行除菌及浓度符合性验证是指使用0.22μm滤膜对5ng/ml生物素标准工作液进行过滤除菌，再结合已知浓度的维生素质控样品（no：4044755861，质控范围：22.3~30.8μg/100g）对生物素标准工作液进行浓度符合性验证。其中，步骤（23）根据gb5009.259-2016食品中生物素的测方法中所需生物素标准溶液体积为5ml，所需生物素标准曲线浓度为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.16、0.2ng/ml，用贮存稳定剂对标准工作液进一步系列梯度浓度标准溶液稀释0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5ng/ml，移取200μl分装入西林瓶能浸满瓶底部的一周且液面高度≤10mm，轻盖上盖子，利用真空冷冻干燥技术进行冻干24h，将标准物质固定化于西林瓶中。其中，步骤（24）所述的包装、贮存是指将已固定化标准物质的西林瓶进行真空压盖并密封置于≤8℃环境保存。本实施例制得的生物素标准品使用时，往每个西林瓶中加入5ml无菌水，涡旋震荡均匀，即可完成生物素标准曲线溶液的制备。实例3.即用型的叶酸离心管标准品本实施例所述的叶酸粉末标准物质购自supelco47866，纯度98.5%。一种高稳定性的即用型叶酸标准品的制备方法，其通过以下步骤制备得到：（30）配制叶酸标准储备液和配制贮存稳定剂；（31）使用上述步骤（30）配制的贮存稳定剂充分混合稀释上述步骤（30）配制的叶酸标准储备液得叶酸标准工作液；（32）对叶酸标准工作液进行除菌及浓度符合性验证；（33）采用真空冷冻干燥技术将所需浓度的叶酸标准混合液固定于容器中；所需浓度的叶酸标准混合液是指使用贮存稳定剂将步骤（32）的叶酸标准工作液稀释至系列梯度浓度标准溶液；（34）包装、贮存。其中，步骤（30）所述的叶酸标准储备液是通过精确称取叶酸粉末标准品，用0.01mol/l氢氧化钠乙醇溶液定容至20μg/ml，获得叶酸标准储备液。其中，步骤（30）所述的贮存稳定剂由以下组份组成：4wt%甘露醇、1wt%葡聚糖、1wt%聚乙烯吡咯烷酮、2wt%海藻糖、2wt%聚乙二醇、0.02m磷酸氢二钠、5mm磷酸二氢钠、0.05wt%聚山梨酯，余量为水，所述贮存稳定剂通过高压灭菌锅121℃灭菌15min备用。其中，步骤（31）所述的叶酸标准工作液是指使用贮存稳定剂稀释叶酸标准储备液至工作液浓度3.2ng/ml。其中，步骤（32）所述的对叶酸标准工作液进行除菌及浓度符合性验证是指使用0.22μm滤膜对3.2ng/ml叶酸标准工作液进行过滤除菌，再结合已知浓度的维生素质控样品（no：4044755861，质控范围：95.16~126.52μg/100g）对叶酸标准工作液进行浓度符合性验证性验证。其中，步骤（33）根据叶酸检测试剂盒实验方法中所需标准溶液体积为150μl，所需叶酸标准曲线浓度为0、0.025、0.05、0.1、0.15、0.2、0.3ng/ml，用贮存稳定剂对标准工作液进一步系列梯度浓度标准溶液稀释0、0.125、0.25、0.5、0.75、1、1.5ng/ml，移取100μl分装入离心管能浸满离心管底部的一周且液面高度≤10mm，轻盖上盖子，利用真空冷冻干燥技术进行冻干22h，将标准物质固定化于离心管中。其中，步骤（34）所述的包装、贮存，将已固定化标准物质的离心管进行真空压盖并密封置于≤8℃环境保存。本实施例制得的叶酸标准品使用时，往每个离心管中加入500μl无菌水，涡旋震荡均匀，移取150μl标准溶液入微孔板孔中，即可完成叶酸标准曲线溶液的制备。对比例1.b12冻干标准品本对比例例中不包括步骤（12）的贮存稳定剂配制及应用，使用b12标准储备液的定容介质代替贮存稳定剂的使用，即25%乙醇溶液，其他条件同实施例1。对比例2.生物素冻干标准品本对比例中不包括步骤（22）的贮存稳定剂配制及应用，使用生物素标准储备液的定容介质代替贮存稳定剂的使用，即50%乙醇溶液，其他条件同实施例2。对比例3.叶酸冻干标准品本对比例例中不包括步骤（32）的贮存稳定剂配制及应用，使用叶酸标准储备液的定容介质代替贮存稳定剂的使用，即0.01mol/l氢氧化钠乙醇溶液，其他条件同实施例3。低温长期贮存稳定性实验将实施例1-3以及对照例1-3制备维生素标准品无菌密封包装，在4℃的条件下放置12个月，分别在0个月、3个月、6个月、9个月、12个月检测其有关维生素含量，再计算出实施例及对比例维生素标准品的损失率（%）。维生素标准品损失率=（维生素标准品固定浓度-实验例维生素检测浓度）/维生素标准品固定浓度*100%。低温长期贮存稳定性对比结果如下表1：4℃实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例30个月0.160.070.230.911.480.783个月0.410.300.621.483.701.956个月0.740.891.177.175.337.949个月1.241.261.7113.277.4712.3112个月1.901.852.1020.4511.3917.91由上表1可见，本发明制备的即用型维生素标准品在低温长期贮存实验中，维生素损失率均小于5%，相比于对比例1、对比例2、对比例3，本发明贮存稳定剂的使用在低温长期维生素贮存稳定性方面具有突出的优势。高温短期贮存稳定性实验将实施例1-3以及对照例1-3制备维生素标准品在4℃、25℃、37℃、60℃的条件下放置7天后，检测其有关维生素标准品含量，再计算出实施例及对比例维生素标准品的损失率（%）。维生素标准品损失率=（维生素标准品固定浓度-实验例维生素检测浓度）/维生素标准品固定浓度*100%。高温短期贮存稳定性对比结果如下表2：7天实施例1实施例2实施例3对比例1对比例2对比例34℃0.160.100.180.961.340.7125℃0.400.570.5311.806.2124.0237℃0.720.861.0723.7617.1144.4060℃1.201.051.33100.00100.00100.00由上表2可见，本发明制备的即用型维生素标准品在高温短期贮存实验中，维生素损失率均小于5%，相比于对比例1、对比例2、对比例3，本发明贮存稳定剂的使用在高温短期维生素贮存稳定性方面具有突出的优势。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种高稳定性的即用型维生素标准品的制备方法及应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。当前第1页12