本发明属于油脂加工技术领域，具体涉及一种卵磷脂脂肪酸位置分布的分析方法。
背景技术：
卵磷脂(phosphatidylcholine,pc)是被誉为与蛋白质、维生素并列的“第三营养素”，其不仅具有调节机体代谢、提高大脑活力、提高记忆力和调节血脂等生理功能，还具有乳化、离型、润湿、抗氧化和发泡等理化功能。因其具有广泛的功能特性，所以在食品、化妆品、医药等领域具有广阔的应用前景。pc的性能主要取决于脂肪酸的组成，其变化反映出重要的代谢和功能差异。因此，pc的分子结构对其摄入速率和摄入总量有重要的影响。更深入地了解pc中脂肪酸的位置分布，可为其生物学功能的研究提供进一步的信息。因此，pc中脂肪酸位置分布的分析方法的发展受到了广泛关注，方法研究也成为了当前的研究热点。
酶解法是分析pc中脂肪酸位置分布的主要方法，其主要是基于脂肪酶或磷脂酶a2对pc的sn-1或sn-2位酯键进行特异性水解及醇解。酶解法主要分为单酶解法和双酶解法，双酶解法需要在两个反应体系中使用两种不同的酶，分别测定pc中sn-1位和sn-2位的脂肪酸组成，分析操作复杂，且准确度较低(j.am.oil.chem.soc.,2004,81:553-557)；单酶解法较双酶解法操作简单，在相关研究中，其只需使用一种sn-1,3位特异性脂肪酶催化pc与95％乙醇醇解，再通过液液萃取分离特定反应产物，甲酯化即可测定得到卵磷脂中脂肪酸的位置分布。该方法反应体系简单，但由于所用乙醇为95％乙醇，产物中含有游离脂肪酸，增加了分析步骤的复杂性，降低了分析结果的准确度；且该分析方法反应时间较长(完全乙醇化需8h)，增加了反应中间产物sn2-lpc酰基转移的风险，降低了分析的准确度。(foodchem.,2012,135:2542-2548)。总之，目前酶解法分析pc中脂肪酸的位置分布时，反应时间较长、步骤复杂且分析准确度较低。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种卵磷脂脂肪酸位置分布的分析方法，该方法分析时间短、操作简单、结果准确且应用范围广。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种卵磷脂脂肪酸位置分布的分析方法，包括以下步骤：
步骤1：将卵磷脂和过量的无水乙醇在反应容器中混合均匀，加热至醇解反应温度后连接回流装置；
步骤2：向反应容器中加入固定化脂肪酶novozym435或lipozyme435，在搅拌状态下进行醇解反应；
步骤3：醇解反应结束后，依次采用水和正己烷对产物进行萃取，萃取结束后，分别收集水相和正己烷相，水相加冷丙酮沉淀后得到sn2-lpc，正己烷相旋蒸除去正己烷后得到脂肪酸乙酯；
步骤4：将得到的脂肪酸乙酯直接进行气相色谱分析，得到的sn2-lpc经甲酯化后，进行气相色谱分析。
优选地，卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40～100。
优选地，步骤1中，醇解反应的温度为25～40℃。
优选地，步骤2中，固定化脂肪酶的添加量为底物总质量的6％～15％。
优选地，步骤2中，搅拌的转速为250～500rpm。
优选地，醇解反应时间为1～3h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明公开的卵磷脂脂肪酸位置分布的分析方法，采用novozym435或lipozyme435在无水乙醇过量的条件下催化卵磷脂在短时间内全部醇解，进而快速准确的分析卵磷脂中脂肪酸的位置分布。novozym435或lipozyme435在无水乙醇过量的条件下对卵磷脂具有极强的sn-1位特异性和极高的反应活性，从而可大大提高醇解反应速率，确保卵磷脂快速全部醇解，避免酰基转移的发生，提高分析结果的准确度；此外，无水乙醇的使用，可有效避免水解副产物脂肪酸的产生，简化后继分析步骤。该方法操作快速、简单、准确，具有较好的推广应用前景。
进一步地，卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40～100，无水乙醇远过量，可保证novozym435或lipozyme435具有较强的sn-1位特异性和反应活性，且可保证novozym435或lipozyme435具有较好的操作稳定性。
进一步地，反应温度为25～40℃，可有效避免因乙醇挥发所导致的反应速率降低，且可保证novozym435或lipozyme435具有较好的操作稳定性。
进一步地，固定化脂肪酶novozym435或lipozyme435的用量为底物总质量的6％～15％，可保证所用脂肪酶在过量乙醇存在情况下对卵磷脂具有较强的sn-1位特异性和酶活性，且可保证反应的经济性。
进一步地，反应时间为1～3h，不仅可保证pc完全转化为sn2-lpc和脂肪酸乙酯，而且可保证novozym435或lipozyme435具有较好的操作稳定性。
进一步地，醇解反应时搅拌的转速为250～500rpm，不仅可保证较高的反应速率，而且可较好的保证所用固定化酶的颗粒完整性。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。如非写明，所有百分比均为质量百分比。
实施例1
称取100g大豆卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:100)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入15gnovozym435，在转速为250rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应1h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，采用液相色谱分析产物组成，结果显示，产物中无pc存在，仅含有sn2-lpc和脂肪酸乙酯，二者摩尔数相等，等于pc的初始摩尔数，表明pc完全转化生成sn2-lpc和脂肪酸乙酯。采用溶剂萃取(依次为水和正己烷)分离sn2-lpc和脂肪酸乙酯。分离得到的水相加冷丙酮沉淀后得到sn2-lpc，甲酯化后通过气相色谱分析确定卵磷脂sn-2位的脂肪酸组成；分离得到的正己烷相旋蒸除去正己烷后得到脂肪酸乙酯，直接采用气相色谱分析确定卵磷脂sn-1位的脂肪酸组成。
实施例2
称取100g大豆卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:40)，搅拌使之混合均匀，加热至25℃后连接回流装置。再向其中加入10glipozyme435，在转速为500rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应3h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，采用液相色谱分析产物组成，结果显示，产物中无pc存在，仅含有sn2-lpc和脂肪酸乙酯，二者摩尔数相等，等于pc的初始摩尔数，表明pc完全转化生成sn2-lpc和脂肪酸乙酯。采用溶剂萃取(依次为水和正己烷)分离sn2-lpc和脂肪酸乙酯。分离得到的水相加冷丙酮沉淀后得到sn2-lpc，甲酯化后通过气相色谱分析确定卵磷脂sn-2位的脂肪酸组成；分离得到的正己烷相旋蒸除去正己烷后得到脂肪酸乙酯，直接采用气相色谱分析确定卵磷脂sn-1位的脂肪酸组成。
实施例3
称取100g大豆卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:60)，搅拌使之混合均匀，加热至40℃后连接回流装置。再向其中加入6gnovozym435，在转速为400rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应3h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，采用液相色谱分析产物组成，结果显示，产物中无pc存在，仅含有sn2-lpc和脂肪酸乙酯，二者摩尔数相等，等于pc的初始摩尔数，表明pc完全转化生成sn2-lpc和脂肪酸乙酯。采用溶剂萃取(依次为水和正己烷)分离sn2-lpc和脂肪酸乙酯。分离得到的水相加冷丙酮沉淀后得到sn2-lpc，甲酯化后通过气相色谱分析确定卵磷脂sn-2位的脂肪酸组成；分离得到的正己烷相旋蒸除去正己烷后得到脂肪酸乙酯，直接采用气相色谱分析确定卵磷脂sn-1位的脂肪酸组成。
实施例4
称取100g蛋黄卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(蛋黄卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:80)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入10glipozyme435，在转速为350rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应2hmin后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，采用液相色谱分析产物组成，结果显示，产物中无pc存在，仅含有sn2-lpc和脂肪酸乙酯，二者摩尔数相等，等于pc的初始摩尔数，表明pc完全转化生成sn2-lpc和脂肪酸乙酯。采用溶剂萃取(依次为水和正己烷)分离sn2-lpc和脂肪酸乙酯。分离得到的水相加冷丙酮沉淀后得到sn2-lpc，甲酯化后通过气相色谱分析确定卵磷脂sn-2位的脂肪酸组成；分离得到的正己烷相旋蒸除去正己烷后得到脂肪酸乙酯，直接采用气相色谱分析确定卵磷脂sn-1位的脂肪酸组成。。
实施例5
称取100g磷虾卵磷脂和无水乙醇的混合物置于500ml圆底烧瓶中(磷虾卵磷脂与无水乙醇的摩尔比为1:60)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入15gnovozym435，在转速为350rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应2hmin后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去无水乙醇，采用液相色谱分析产物组成，结果显示，产物中无pc存在，仅含有sn2-lpc和脂肪酸乙酯，二者摩尔数相等，等于pc的初始摩尔数，表明pc完全转化生成sn2-lpc和脂肪酸乙酯。采用溶剂萃取(依次为水和正己烷)分离sn2-lpc和脂肪酸乙酯。分离得到的水相加冷丙酮沉淀后得到sn2-lpc，甲酯化后通过气相色谱分析确定卵磷脂sn-2位的脂肪酸组成；分离得到的正己烷相旋蒸除去正己烷后得到脂肪酸乙酯，直接采用气相色谱分析确定卵磷脂sn-1位的脂肪酸组成。
对比例1
称取100g大豆卵磷脂和乙醇(95％)的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆卵磷脂与95％乙醇的摩尔比为1:100)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入15glipozymermim，在转速为250rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应6h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去乙醇和水。采用液相色谱分析产物组成，结果显示，产物中含有3.31mol％pc存在，表明pc没有完全转化生成sn2-lpc和脂肪酸乙酯。
对比例2
称取100g大豆卵磷脂和乙醇(95％)的混合物置于500ml圆底烧瓶中(大豆卵磷脂与95％乙醇的摩尔比为1:100)，搅拌使之混合均匀，加热至30℃后连接回流装置。再向其中加入15glipozymermim，在转速为250rpm的磁力搅拌条件下进行反应，待反应8h后，回收固定化脂肪酶，在旋转蒸发器上除去乙醇和水。采用液相色谱分析产物组成，结果显示，产物中无pc存在，含有sn2-lpc、脂肪酸乙酯和脂肪酸等，但脂肪酸乙酯和脂肪酸的摩尔数之和略高于sn2-lpc的摩尔数，且三者摩尔数之和为pc初始摩尔数的2倍，表明反应过程中发生了微弱的酰基转移。采用溶剂萃取(依次为水和正己烷)分离sn2-lpc、脂肪酸乙酯和脂肪酸。分离得到的水相加冷丙酮沉淀后得到sn2-lpc，甲酯化后通过气相色谱分析确定卵磷脂sn-2位的脂肪酸组成；分离得到的正己烷相旋蒸除去正己烷后得到脂肪酸乙酯和脂肪酸，甲酯化后通过气相色谱分析确定卵磷脂sn-1位的脂肪酸组成。相比于实施例1～5，由于醇解过程中发生了酰基转移，从而降低了分析结果的准确度；此外，反应产物中含有少量脂肪酸，因此需要将分离得到的脂肪酸乙酯和脂肪酸甲酯化后再进行气相色谱分析，增加了分析步骤的复杂性。总之，该方法反应时间长、操作步骤繁琐，且反应结果准确性较低。