专利名称：花生AhFatA蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及花生AhhtA蛋白及其编码基因与应用，属于分析生物学与生物技术领域。
背景技术：
高等植物酰基-ACP硫酯酶O^at)是一种终止脂肪酸合成的酶，可在质体游离脂肪酸的生物合成过程中将acyl-ACPs水解脱去ACP，产生游离的脂肪酸。1992年，Voelker 等指出FAT直接决定了脂肪酸从头合成途径中脂酰基链的长度(Voelker T A, Worrell A C, AndersonL. et al. Fatty acid biosynthesis redirected to medium chains in transgenic oilseed plants [J]. Science, 1992, 257 :72-74.)。花生酰基-ACP 硫酯酶对花生物种子中贮存态的脂肪酸种类和含量、从质体输出脂肪酸的链长和饱和性都起着关键的作用。FatA的酶主要对18 I-ACP有活性，对18 O-ACP也有活性。1998年，Deborah J. Hawkins和Jean C. Kridl在莽吉柿种子cDNA中克隆到两条FatA序列，在体外表达时，发现对C18:1-ACP有特异性的!^atAl也有很强的C18:0_ACP的特异性，构建了含莽吉柿!^atAl基因的转基因油菜，结果在检测菜籽油中脂肪酸的种类及其含量时，含量本应很低的硬脂酸竟然占油菜种子油脂总量的20%以上，这个结论充分说明了莽吉柿!^atAl有很强的 C18:0-ACP 的特异性(Hawkins D J, Kridl J C. Characterization of acyI-ACP thioesterase of mangosteen(Garcinia magostana)seed and high levels of stearate production in transgenic canola[J]. The Plant Journal,1998,13 (6))。目前已从向日葵、油菜、拟南芥、蓖麻、山竹等多种植物中获得!^atA基因片段[M. J. Serrano-Vega · R. Garces · Ε. Marti nez-Force. Cloning, characterization and structural model of a FatA-type thioesterase from sunf1 ower seeds (Helianthusannuus L.). Planta (2005) 221 :868-880]。但是，国内外在目前的现有技术中对此基因的研究很少，在花生中尚没有对!^atA基因的报道。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种花生AhhtA蛋白及其编码基因与应用。一种花生Ahi^atA蛋白编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。一种插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的载体。一种插入了包含上述SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列载体的重组细胞。由上述花生Ahi^atA蛋白编码基因表达的Ahi^atA蛋白，具有SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列。上述花生Ahi^atA蛋白编码基因、载体或重组细胞在花生品质改良中的应用。本发明从花生(Arachis hypogaea)中克隆的Ahi^atA蛋白编码基因，这在国内外尚属首例。该基因通过影响花生酰基-ACP硫酯酶的表达量，对花生种子中贮存态的脂肪酸种类和含量进行调节，同时还对花生种子中从质体输出的脂肪酸的链长和饱和性进行调节。该基因在花生或其它油料作物种子中的过量表达，可增强其脂肪酸中C18:l脂肪酸的含量，进而提高种子中的含油量，实现花生或其它油料作物品质的改良，因此，具有重要的经济效益和社会效益。
图1半定量法表示花生Ahi^atA基因在花生根、茎、叶、花和种子中的表达情况。图2半定量法表示花生Ahi^atA基因在花生果针入土后10天、20天、30天、40天、 50天、60天、70天的种子中的表达情况。图3拟南芥种子脂肪酸气象色谱检测结果；其中FATA正义花生AhhtA正义基因转化拟南芥后的第T3代转基因拟南芥种子，AhFatA反义花生Ahi^atA反义基因转化拟南芥后的第T3代转基因拟南芥种子，WT 野生型拟南芥种子。
具体实施例方式实施例1花生Ahi^atA蛋白编码基因的克隆，具体步骤如下1、5‘端序列确定根据GenBank数据库中EST序列信息及山竹、葡萄、芜菁、芥菜型油菜、拟南芥、萼苣花、紫苏和德国鸢尾氨基酸比对确定所获得的EST序列5’端包含AhFATA 基因起始密码子ATG;2、花生未成熟种子总RNA获得以鲁花14花生未成熟种子为材料，采用改良CTAB 法提取鲁花14未成熟种子总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA含量及质量；3、目的基因cDNA片段的获取以获得的鲁花14未成熟种子总RNA为模板，采用 TaKaRa3 ‘-Full RACE Core Set Ver. 2. 0 反转录合成 3 ‘RACE Ready cDNA ；4、设计引物根据GenBank数据库中EST序列信息设计引物FA-f 5' -TTCGTCGGAGGAGTGTATC-3，，(SEQ ID NO.3)FA-r 5' -CTCTCAAGAACCCAACCAAT-3，，(SEQ ID NO. 4)以3 ‘RACE Ready cDNA为模板，进行PCR扩增，反应程序如下94°C预变性5min， 94°〇变性308，601复性308，721延伸lmin，35个循环后，72°C IOmin, PCR扩增结束后对 PCR产物进行电泳；5、电泳后用全式金生物公司胶回收试剂盒对目的基因进行回收，程序如下(1)紫外灯下用干净、锋利的手术刀割取尽量小的带有目的条带的琼脂糖块 (100mg-200mg)，置于 1. 5mL 离心管中；(2)以凝胶质量毫克数溶胶液体积微升数为1 3的比例加入Extraction Buffer，于恒温金属浴中50°C温育lOmin，得混合液；(3)将步骤(2)制得的混合液全部转至Spin column内，室温6000rpm离心lmin，
弃去管内液体；(4)力口 500uL Extraction Buffer 于 Spin column 内，12000rpm 离心 lmin,弃去管内液体；(5)向 Spin column 内加 750uL Wash buffer，12000rpm 离心 lmin，弃去管内液体；(6)2000rpm 离心 lmin，将 Spin column 转移至 1. 5mL 无菌离心管中；(7)超净工作台上晾干；(8)向 Spin column 内加 45uL Elution Buffer，室温静置 2min，12000rpm 离心 lmin,目的片段存在于离心管内的液体中。6、回收的目的片段与pGEM-T easy (购自Promoga公司)载体连接用T4 DNA Iigase (购自TaKafci公司)将目的基因片段与pGEM-T easy载体连接，连接体系为10X T4 DNA Ligastion Buffer IuL,目的 PCR片段 5uL，pGEM_T easy载体 luL,T4 DNA Ligase (3U/uL)luL，ddH20 2uL。16°C过夜连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α。7、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化(1)从37°C培养18 20h的培养基平板上挑取大肠杆菌DH5 α单菌落于30mL LB 液体培养基中，37°C，250r/min振荡过夜培养；(2)按1/(50 100) (V/V)的量转入新鲜LB液体培养基中，37°C振荡培养至0D600 =0. 4 0. 6 ；(3)菌液转移至无菌离心管种冰浴20min，使培养物冷却至0°C，4°C，7000rpm离心 5min，收集菌体；(4)弃去上清，倒尽残液，向沉淀中加入0. 6倍体积冰上预冷的lOOmmol/L CaCl2, 枪头吸打混勻，冰浴20min ；(5)4°C，7000rpm离心5min，弃上清，向沉淀中加入IOOuL冰预冷的IOOmmol/L CaCl2，枪头吸打混勻，置4°C冰箱备用，或将制备的感受态细胞加入20%无菌甘油，超低温冰箱一70°C长期保存；(6)将IOuL带目的片段的重组质粒加入到50uL大肠杆菌DH5 α感受态细胞中(体积不超过感受态的5% )，轻轻混勻，对照管不加，冰浴30min ；(7) 420C，热激90s后迅速置于冰浴2 !Bmin ；(8)各加入 85OuL LB 液体培养基，37°C，I5O-I7Orpm 复活 45min ；(9)取200uL平铺到含有氨苄青霉素(50mg/mL)和5_溴-4-氯-3-吲哚-β -d_半乳糖O0mg/mL)的LB固体平板上，用玻璃涂棒涂勻，37°C培养约3小时至菌液被完全吸收， 将平板倒置，37°C过夜后4°C保存平板；8、菌落PCR检测阳性克隆配制好PCR反应液(不加模板)后用无菌牙签挑取抗性平板上的白色单菌落， 在反应液中轻点几下，进行菌落PCR，反应体系如下10X PCR buffer 3uL, dNTP (2. 5mM each) 2. 5uL, Mg2+2uL, Taq (5U/uL) 0. 5uL,引物 L-F(IOuM) IuL,引物 L-R(IOuM) IuL, ddH20 20uL。扩增程序为94°C预变性5min，94°C变性30s，60°C复性30s，72°C延伸lmin, 35个循环后，72°C lOmin，扩增结束后取lOuLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；9、质粒DN A提取用天根公司质粒小提试剂盒，具体步骤如下(1)挑取菌落PCR阳性的菌落接种于30mL含有氨苄青霉素(50ug/mL)的LB液体培养基中，37°C，180rpm，过夜培养；
(2)取1. 5mL过夜培养的菌液加入1. 5mL离心管中；(3)常温下12，OOOrpm离心lmin，弃去上清液；(4)加250uL溶液Pl，重悬细菌体沉淀(重悬后没有细菌团块)；(5)加250uL溶液P2，上下翻转4 6次使菌体充分裂解，反应时间不超过5分钟；(6)力Π 350uL溶液P3，立即温和地上下翻转离心管4 6次，溶液应该出现絮状物， 但不会出现局部沉淀；(7)于 12，OOOrpm 离心 IOmin ；(8)离心后得到的上清液转移到Spin column内，于6，OOOrpm离心lmin，并弃去
收集管内液体；(9)向Spin column内加750uL漂洗液Pff,于12，OOOg离心30 60秒，并弃去接液管内液体后，再次加入650uL Wash Buffer,于12，OOOg离心30 60秒，弃去接液管内液体；(10) 12，OOOg离心2min，将Spin column转移到无菌的1. 5mL离心管中，室温晾干；(11)向 Spin column 内加 50uL Elution Buffer，室温静置 lmin ；(12)于12，OOOg离心lmin (1. 5mL离心管内溶液中含有质粒DNA)；10、对提取的质粒DNA进行酶切验证，阳性质粒送山东省农科院高新技术研究中心测序；11、目的基因全长序列获得根据GenBank数据库中公布的5 ‘端EST序列及测序获得的3 ‘端序列拼接后得到目的基因全长序列，并设计全长序列扩增引物AhFatA-f 5' -CTACCATGGAATGTTGAAGGTTTCAT-3，，(SEQ ID NO. 5)AhFatA-r 5' -CATCACGTGGATCATAATCTTGAAGCT-3，，(SEQ ID N0. 6)扩增程序如下94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸lmin，35 个循环后，72°C IOmin,按上述步骤5 9进行操作后获得花生脂酰-ACP硫脂酶基因全长序列，命名为花生Ahi^atA蛋白编码基因。经测序，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。实施例2Ah!^itA基因的序列信息与特性分析花生Ahi^atA蛋白编码基因全长1650bp，开放阅读框为1119bp，位于189_1307bp 处。BioXM软件分析表明Ahi^atA基因共编码372个氨基酸。根据PR0SITE SCAN数据库分析花生Ahi^atA基因编码的氨基酸，发现此序列包含N端糖基化位点(N-glycosylation site, PS00001)；环磷酸腺苷和环磷酸鸟苷依赖性蛋白激酶磷酸化位点(cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site, PS00004)；蛋白激 Bl C 舞酸化位点(Protein kinase C phosphorylation site, PS00005)；酪蛋白激酶 II 磷酸化位 ^ (Casein kinase Ilphosphorylation site, PS00006) ； (Tyrosine kinase phosphorylation site, PS00007) :N_ 端十四烧酰化位点(N-myristoylation site, PS00008)；微体C-末端定位信号(Microbodies C-terminal targeting signal，PS00342)。用ProtParam预测编码蛋白的物理化学性质，推测其分子式C1835H2938N538O558S17， 分子量为42009. 8，等电点为6. 73，理论推导半衰期为30h，不稳定参数是39. 15，属于稳定蛋白。该蛋白中含量相对较多的氨基酸是Leu(9. )，Arg(8.9% )，Val(8.9% )，Gly(7. 5%),Ser(7.0% ),Glu(7.0% )；并且该蛋白中不含Pyl和kc。总的带正电荷残基为(Arg+Lys) :48总的带负1电荷的残基为(Asp+Glu) :49。该蛋白亲水性平均数为-0. 365， 预测该蛋白为疏水性蛋白。用SignalP 3. (Server进行预测，表明该蛋白不含信号肽序列， 为非分泌性蛋白。以TMHMM2program为基础的跨膜结构预测表明该蛋白不含跨膜结构。采用在线HNN网站预测花生Ahi^atA蛋白二级结构，表明该蛋白含有34. 14%的 α -螺旋，20. 97%的β -折叠以及44. 89%的无规则卷。用3D-JIGSAW预测花生Ahi^atA蛋白的三级结构，结果表明该蛋白呈紧密的球状结构。实施例3单链cDNA的获得及Ahi^atA在鲁花14不同组织中的表达模式分析分别以鲁花14的根、茎、叶、花、种子和鲁花14果针入土后10天、20天、30天、 40 天、50 天、60 天、70 天种子的总 RNA 为材料，利用 PrimeScript 1st Strand cDNA SynthesisKit(TaKaRa)试剂盒反转录的cDNA为模板，根据GenBank中β -actin序列设计 1对引物F 5 ‘-GCAGGGCGTGATTTAACTG-3，，(SEQ ID NO. 7)R 5 ‘-CTCCGATCCAGACACTGTACT-3，. (SEQ ID NO. 8)以β -actin为内参基因进行半定量RT-PCR分析硫脂酶基因Ahi^atA在鲁花14不同组织中的表达量。AhhtA引物AhFatA-RT-F 5 ‘-CAATAAGACTGCCACCGT-3，，(SEQ ID NO. 9)AhFatA-RT-R 5 ‘-TCAAGAACCCAACCAAT-3，，(SEQ ID NO. 10) PCR 反应条件为: 940C 5min，后 94°C 30s, 58°C 30s, 72°C Imin 进行四个循环；最后 72°C lOmin，反应结束后， 进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示Ahi^aU在鲁花14花生各部位中都有表达，其中种子中表达量最高，在叶、花中表达量次之，在根中表达稍低，在茎中几乎不表达(如图1所示)；AhhtA在花生果针入土后第10天到第70天都有表达，其中第10天表达量较低，第30 天表达量最高(如图2所示)。实施例4花生Ahi^atA基因正反义表达载体的构建(1)根据分离出的花生AhhtA基因核苷酸序列，设计引物正义正向引物5，—CTACCATGGAATGTTGAAGGTTTCAT—3'(SEQ ID N0. 11)正义反向引物5，—CATCACGTGGATCATAATCTTGAAGCT—3'(SEQ ID N0. 12)反义正向引物5，—CTACACGTGAATGTTGAAGGTTTCAT—3'(SEQ ID N0. 13)反义反向引物5，—CATCCATGGGATCATAATCTTGAAGCT—3'(SEQ ID N0. 14)(2)以花生种子总RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR反应。反应程序如下 模板 cDNAl μ L, 2 Xpfu MixlO. OyL, primerl (IOum) 0. 5 μ L, primer2 (IOum) 0. 5 μ L, ddH208. 0 μ L。PCR 反应条件为94°C 预变性 5min，94°C变性 30s，55 °C 复性 30s，72 °C 延伸 lmin，35个循环后，72°C IOmin结束反应。取5yL PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，切胶回收，连接PGEM-T easy载体(购自progenia公司)，转化大肠杆菌DH5 α， 蓝白斑筛选后挑取白色菌落在LB液体培养基中摇菌，提取质粒DNA进行序列测定，具体方法同实施例1中步骤5 10。(3)用NcoI和RnlI两个限制性内切酶将花生Ahi^atA正反两个基因从pGEM_T easy载体上切下，与同样经NcoI和PmlI酶切的pCAMBIA3301载体(购自cambia公司)连接，连接产物转化DH5 α感受态细胞，然后在含卡那霉素的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。将构建好的正反义表达载体转化农杆菌LBA4404。实施例5农杆菌转化拟南芥(1)挑取转化后的农杆菌单克隆于含50μ g/ml卡那霉素的YEP液体培养基中， 28°C、200rpm振荡培养至0D_ = 0. 6，离心收集菌体，5 %蔗糖溶液(0. 02% Silwet L-77) 溶液悬浮沉淀，得渗透液；(2)将盛花期拟南芥花序浸入步骤(1)制得的渗透液中，浸泡5分钟；(3)收获经浸泡花序的拟南芥的种子并在筛选培养基上筛选，得到抗性植株；(4)培育步骤(3)制得的抗性植株，获得Tl代纯合株系种子并种植于培养室，2月后观察生长状况。实施例6转基因拟南芥的获得(1)收获实施例4种植的拟南芥的种子，种植该种子并收获第二代种子；(2)萌发少量第二代种子，通过提取DNA进行PCR检测、Southern杂交方法，验证转基因植株，获得转基因拟南芥；(3)测定转基因拟南芥种子中脂肪酸的含量。表1为经气象色谱检测的拟南芥种子中脂肪酸含量。表 1
C16:0C16:lC18:0C18:lC18:2C18:3C20:0C20:lC20:2C20:3WT2.077.953.913.7329.3717.52.8520.371.810.45FatA 正2.018.072.0218.8530.5615.212.4319.491.150.21FatA 反2.357.84.511.729.8517.563.0720.12.320.75注WT 为野生型拟南芥种子；FatA正转正义花生Ahi^atA基因得T3代转基因拟南芥种子；FatA反转反义花生Ahi^atA基因得T3代转基因拟南芥种子。由表1可看出，与野生型相比，转正义Ahi^atA的拟南芥种子中C18:1含量增加了 4. 92%，进而使拟南芥种子中C18:2含量也稍有升高；转反义Ahi^atA的拟南芥种子中 C18:l 含量下降了 2. 03%，而其它脂肪酸如 C16:0、C16:1、C18:0、C18:2、C18:3、C20:0 无明显变化。表明过量表达花生硫脂酶基因AhhtA可以有效提高转基因作物中脂肪酸中C18:l 的含量，同时可有效提高种子含油量。对于改良作物品质，提高生物量具有重要的意义。
权利要求
1.一种花生Ahi^atA蛋白编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列的载体。
3.一种插入了包含SEQ ID No. 1所示核苷酸序列或含有SEQ ID No. 1序列载体的重组细胞。
4.权利要求1所述花生Ahi^atA蛋白编码基因表达的Ahi^atA蛋白，具有SEQID NO. 2 所示氨基酸序列。
5.权利要求1所述的花生Ahi^atA蛋白编码基因、权利要求2所述的载体或权利要求3 所述的重组细胞在花生品质改良中的应用。
全文摘要
本发明涉及花生AhFatA蛋白及其编码基因与应用，属于基因工程技术领域。一种花生AhFatA蛋白编码基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示由上述花生AhFatA蛋白编码基因表达的AhFatA蛋白，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。本发明为下一步在花生中对AhFatA基因进行过量表达及抑制表达研究，提高花生种子含油量和实现花生品质改良的研究奠定基础。
文档编号C12N1/15GK102492704SQ201110368839
公开日2012年6月13日 申请日期2011年11月18日 优先权日2010年11月30日
发明者单雷, 唐桂英, 张斌, 彭振英, 李兰, 毕玉平, 陈高 申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心