再用热水提取30min，样品于45 V烘干备用。称取烘干后的样品50mg，加入ImL新鲜配置的的反应液(终浓度为2.5%的三氟化硼乙醚和10%的乙硫醇溶于二氧六环)，置100°C恒温烘箱反应4h，再置于-20°C停止反应。12000rpm离心lOmin，取上清液300 μ L，加入0.2mL浓度为0.lmg/mL的正二十二烧(溶于二氯甲烧)，用0.4mol/L的碳酸氢钠调PH为3?4 (约0.3mL)，加2mL超纯水和ImL 二氯甲烧，涡旋，静置分层。吸取下层有机相500 μ L，于45°C恒温烘箱中烘干备用。得到的烘干物质重新溶于0.4mL的二氯甲烷中，加入50 yL嘧啶和10yL N，O-双三甲基硅基乙酰胺，25°C静置4h，取2 μ L进GC-MS分析。
[0042]2.2GC-MS条件控制为:载气为高纯氦气，流速为1.19ml/min ;进样口温度为250 0C ;分流比进样模式，分流比为20:1 ;进样量2 yL ;柱升温程序为:初始温度50 °C，以350C /min升温至220°C，再以0.5°C /min升温至230°C，最后以50°C /min升温至280°C，保留时间7min，电子轰击(EI)离子源温度为230°C，电子能量为70eV ;接口温度280°C ;溶剂延迟3min ;扫描范围40-650amu ;电子倍压器为0.9kV。
[0043]衍生的G和S木质素单体可依据其分子离子峰做定性鉴定，实验结果见图1，从图1中可见，两种类型的木质素单体能有效的被分离鉴定，其中荷质比(m/z) 269为G木质素单体;m/z 299为S木质素单体。两种单体的定量可根据GC的信号响应因子k来定量，k等于样品与内标的浓度之商比上样品与内标的相对峰面积之商，本实验中k为1.5，利用已知的k、内标二十二烷的浓度、内标峰面积、样品峰面积，即可计算出两种木质素单体在反应液中的浓度，再结合样品的用量，即可得到干样中两种木质素单体的含量，单位(ymol/g)。
[0044]对测定的两种梨果木质素单体的含量进行比较，绘制了含量柱状图，结果见图2，由图2可见褐皮芽变品系‘锈酥’果皮中G、S两种木质素单体含量均明显高于‘砀山酥梨’，上述结果可为进一步研宄木质素与果皮色泽的关系提供数据支持。
【主权项】
1.一种梨果皮中木质素单体含量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤: 取样品用液氮研磨，经有机相和热水提取后，烘干，然后采用三氟化硼和乙硫醇提取，再加入内标正二十二烷，再烘干后用嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺衍生化，用气相色谱-质谱联用仪分析。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)液氮研磨样品，有机溶剂初提，热水提取，烘干； 2)置于反应液中反应； 3)离心取上清，加入正二十二烷、水和二氯甲烷涡旋静置分层； 4)有机相提取后烘干； 5)得到的烘干物质重新溶于二氯甲烷，加入嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺，静置后用气相色谱-质谱联用仪分析。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括以下步骤:1)液氮研磨样品，分别用丙酮、甲醇各提取，再用热水提取，烘干； 2)按照一定的质量体积比，将烘干后的样品加入反应液中，置恒温烘箱反应； 3)离心取上清，加入溶于二氯甲烷的正二十二烷，用碳酸氢钠调PH为3?4，加超纯水和二氯甲烷，涡旋，静置分层； 4)吸取下层有机相，于恒温烘箱中烘干； 5)得到的烘干物质重新溶于二氯甲烷，加入嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺，静置后用气相色谱-质谱联用仪分析。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)液氮研磨样品，分别用丙酮、甲醇各提取，再用热水提取，45°C烘干； 2)按照质量体积比为50:1，将烘干后的样品加入反应液中，置100°C恒温烘箱反应4h，再置于_20°C停止反应； 3)12000rpm离心lOmin，取上清液，按照样品与溶于二氯甲烧的正二十二烧的体积比3:2，加入正二十二烧，用碳酸氢钠调PH为3?4，加2mL超纯水和ImL 二氯甲烧，涡旋，静置分层； 4)吸取下层有机相500yL，于45°C恒温烘箱中烘干； 5)得到的烘干物质重新溶于二氯甲烷，加入嘧啶和N，O-双三甲基硅基乙酰胺，静置后用气相色谱-质谱联用仪分析。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的反应液是通过将终浓度为2.5%的三氟化硼乙醚和10%的乙硫醇溶于二氧六环制得的。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用仪的分析条件为:进样口温度为240?260°C，电子轰击离子源温度为220?240°C，接口温度270?290 0C ;溶剂出峰时间延迟3?4min。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述气相色谱-质谱联用仪的分析条件为:进样口温度为250°C，电子轰击离子源温度为230°C，接口温度280°C ;溶剂出峰时间延迟 3min。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括如下步骤:根据分子离子峰来定性，其中质荷比269为G木质素单体，荷质比299为S木质素单体。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤:根据正二十二烷的浓度，峰面积，气相响应因子k来定量，从而计算出样品中两种木质素单体的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的响应因子k为1.5。
【专利摘要】本发明提供了一种梨果皮中木质素单体含量的测定方法，该方法包括以下步骤：取样品用液氮研磨，经有机相和热水提取后，烘干，然后采用三氟化硼和乙硫醇提取，再加入内标正二十二烷，再烘干后用嘧啶和N,O-双三甲基硅基乙酰胺衍生化，用气相色谱-质谱联用仪分析。然后根据分子离子峰来定性，其中质荷比(m/z)269为G木质素单体，m/z 299为S木质素单体。根据正二十二烷的浓度，峰面积，气相响应因子k来定量，从而计算出样品中两种木质素单体的含量。本发明提供的测定梨果皮中木质素单体含量的方法操作简单，可为研究果皮中木质素单体对果皮色泽的影响提供依据，进而为进一步调控梨果皮色泽奠定理论基础。
【IPC分类】G01N30-02
【公开号】CN104535678
【申请号】CN201410810274
【发明人】衡伟, 朱立武, 王孟东, 叶振风, 贾兵, 刘莉, 刘普
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月22日