超声清洗，超声清洗的时间分别为3min。再将上述电极放入
0.lmol/L的稀H2SO4*，通过电化学方法对其进行彻底清洗，即得干净的金电极。
[0049]2、修饰的金电极的制备:将经过预处理的金电极浸泡在50nmol/L的巯基化ssDNA溶液(用PH 7.0磷酸缓冲溶液配制)中浸泡16h，再将该电极浸泡在lmmol/L的巯基己醇溶液中lh，得ssDNA探针修饰金电极。
[0050]3、DNA电化学传感器的制备:将修饰的金电极浸泡在0.5mg/mL的导电纳米材料溶液中0.5h反应，即得。
[0051]4、将上述3中所得电极浸泡在目标链DNA 1\溶液中室温反应1.5h，即得。
[0052]所用核酸分子探针为单链DNA分子探针的两条DNA链分别为(5’端至3’端):
[0053]ssDNA:5’ -HS-(CH2)6-AGT CAG TGT GGAAAATCT CTA GC-3’
[0054]T1:5’ -GCTAGA GAT TTT CCA CAC TGA CT-3’
[0055]本实施案例所用DNA由上海生工合成及修饰。该DNA序列为随机选定，可用于所设计的传感器的检测，但并不限于该序列。
[0056]本实例电化学核酸传感器的性能分析:
[0057]参见图4。我们用差分脉冲伏安法(DPV方法)表征了金电极每一步修饰的过程。从图4中可以看出，裸金电极有很强的还原峰(曲线a)。巯基化ssDNA和巯基己醇通过Au-S相互作用对金电极进行修饰(巯基己醇用来封闭金电极多余的位点，防止非特异性吸附)，由于DNA的负电性阻挡了 Fe(CN)63_/4_的电子转移，因而DPV曲线中，还原峰电流值下降(曲线b)。当导电性良好的石墨纳米颗粒与ssDNA因相互作用结合到金电极表面之后，氧化还原过程中的电子转移过程通过石墨纳米颗粒传输到电极表面，从而使得DPV信号得到恢复，还原峰电流值增加(曲线c)。当检测物中含有互补链的DNA时，目标链与DNA探针进行杂交，形成刚性的双螺旋结构。由于石墨纳米颗粒与ssDNA的静电吸附作用弱于碱基互补配对作用，石墨纳米颗粒从ssDNA上脱离下来，氧化还原过程中电子的转移再次受阻，导致DPV信号中还原峰电流值下降(曲线d)。该方法表征结果说明该传感器对目标链DNA具有良好的检测性能。
[0058]实施案例2
[0059]1、金电极的预处理:将金电极分别用0.3 ym、50nm的抛光粉进行抛光5min，再分别用丙酮、乙醇、超纯水进行超声清洗，超声清洗的时间分别为5min。再将上述电极放入
0.3mol/L的稀H2SO4*，通过电化学方法对其表面进行彻底清洗，即得干净的金电极。
[0060]2、ssDNA探针修饰金电极的制备:将经过预处理的金电极浸泡在50nmol/L的巯基化ssDNA溶液(用pH 7.0的磷酸缓冲溶液配制)中浸泡24h，再将该电极浸泡在lmmol/L的巯基己醇溶液中1.5h，即得修饰的金电极。
[0061]3,DNA电化学传感器的制备:将修饰的金电极浸泡在0.5mg/mL的导电纳米材料溶液中0.5h反应，即得。
[0062]4、将上述3中所得电极浸泡在互补链DNA溶液中室温反应lh，即得。
[0063]所用核酸分子探针为单链DNA分子探针的两条DNA链分别为(5’端至3’端):
[0064]5’ -HS-(CH2)6-AGT CAG TGT GGAAAA TCT CTA GC-3，
[0065]5， -GCTAGA GAT TGT CCA CAC TGA CT-3’
[0066]本实施案例所用DNA由上海生工合成及修饰。该DNA序列为随机选定，可用于所设计的传感器的检测，但并不限于该序列。
[0067]本实例电化学核酸传感器的性能分析:
[0068]参见图5。我们用差分脉冲伏安法(DPV方法)表征了金电极每一步修饰的过程。从图5中可以看出，裸金电极有很强的还原峰(曲线a)。巯基化ssDNA和巯基己醇通过Au-S相互作用对金电极进行修饰(巯基己醇用来封闭金电极多余的位点，防止非特异性吸附)，由于DNA的负电性阻挡了 Fe(CN)63_/4_的电子转移，因而DPV曲线中，还原峰电流值下降(曲线b)。当导电性良好的石墨纳米颗粒与ssDNA因相互作用结合到金电极表面之后，氧化还原过程中的电子转移过程通过石墨纳米颗粒传输到电极表面，从而使得DPV信号得到恢复，还原峰电流值增加(曲线C)。当检测物中含有单碱基错配的互补链的DNA时，目标链与DNA探针进行杂交，形成刚性的双螺旋结构。由于石墨纳米颗粒与ssDNA的静电吸附作用弱于碱基互补配对作用，石墨纳米颗粒从单链DNA上脱离下来，氧化还原过程中电子的转移再次受阻，导致DPV信号中还原峰电流值下降(曲线d)。但是由于单碱基错配的互补链与探针DNA链杂交的效率较低，因此，从单链DNA上脱附下来的石墨纳米颗粒量较小，因而，DPV信号变化也较小。该方法表征结果说明该传感器对目标链DNA具有良好的特异性检测性能。
【主权项】
1.一种DNA电化学生物传感器，其特征在于:以金电极(I)作为基底电极，利用Au-S化学作用将巯基化ssDNA分子探针(2)修饰到基底电极上，以与ssDNA结合的导电纳米材料(3)作为电化学转换器，利用可溶性电化学活性试剂的电极反应变化来对目标物(4)进行检测。
2.如权利要求1所述的DNA电化学生物传感器的制备方法，其包括以下步骤: 步骤(I):ssDNA探针修饰金电极的制备:将已经过洁净处理的金电极浸泡在巯基化ssDNA探针溶液中进行探针修饰，再将该电极浸泡在巯基己醇溶液中以封闭电极的多余位点，即可得到ssDNA探针修饰金电极； 步骤⑵:电化学DNA生物传感器的制备:将步骤(I)制备得到的ssDNA探针修饰金电极浸泡在含有导电纳米材料的溶液中，反应一段时间，即得电化学DNA生物传感器。
3.如权利要求2所述的DNA电化学生物传感器的制备方法，其特征在于:步骤(I)中，反应温度为15?35°C，ssDNA探针的修饰时间为16?24小时，ssDNA探针溶液的浓度为0.0l?10 μmol/L，疏基己醇浓度为0.1?10mmol/L
4.如权利要求2所述的电化学DNA生物传感器的制备方法，其特征在于:所述步骤(2)中，反应温度为15?35°C，反应时间为0.5?4小时，溶液浓度为0.5?5mg/mL。
5.如权利要求书I所述的DNA电化学生物传感器，所述导电纳米材料(3)为碳纳米材料或金属纳米材料。
6.根据权利要求书5所述的电化学DNA生物传感器，其特征在于:所述碳纳米材料为石墨纳米颗粒、石墨稀、氧化石墨稀、还原氧化石墨稀、石墨稀量子点、单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、羧基化碳纳米管或氨基化碳纳米管。
7.根据权利要求书5所述的DNA电化学生物传感器，其特征在于:所述金属纳米材料为纳米金、纳米银、纳米铜、纳米锌或纳米钼及复合颗粒。
8.如权利要求书I所述的的DNA电化学生物传感器，其特征在于所述的可溶性电化学活性试剂为带负电荷的电化学活性试剂。
【专利摘要】本发明一种DNA电化学生物传感器及其制备方法，其包括金电极、与目的DNA序列互补的互补DNA、导电纳米颗粒以及可溶性电化学活性试剂，其中一段互补的单链DNA作为捕获探针组装于金电极上，并利用该单链DNA与导电纳米颗粒的结合作为电化学信号的转换单元，对DNA杂交事件进行电化学响应。该方法将吸附了导电纳米颗粒的巯基化DNA修饰金电极作为信号转换电极，利用可溶性电化学活性试剂的电极反应，基于DNA序列之间的碱基互补配对作用，对目标物DNA进行电化学响应和检测。该传感器结构简单、制备工艺简便、灵敏度高，可用于DNA分子的快速检测，而且，该DNA电化学传感器具有可以重复使用的特点。
【IPC分类】G01N27-327
【公开号】CN104569101
【申请号】CN201410828548
【发明人】王媛媛, 苏磊, 佟莹, 杨涵焜, 舒桐, 龚伟, 张学记
【申请人】北京科技大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月26日