在 体系中存在，蛋白质添加量不是其溶解度。因此，蛋白质在溶剂中的分散通常分两部分，一 是溶解，二是以小颗粒分散。溶解的蛋白质稳定分散在溶剂中，但分散的蛋白质小颗粒在离 心力的作用下会沉淀析出，而且沉淀析出量随离心速度的增加而增加。据此，本发明提出采 用超声辅助快速分散、差速离心测蛋白质胶体稳定性的方法，测定蛋白质的溶解度：（1)当 加入的蛋白质较少时，溶解占主要部分，采用差速离心操作后，当测定蛋白质胶体溶液经过 差速离心后的蛋白质浓度，并计算各离心速度下对应的蛋白质浓度的标准方差S时，S较 小；（2)随着蛋白质加入量的增加，蛋白质小颗粒分散所占比例在所制备的蛋白质-溶剂胶 体分散体系中增大，整个分散体系的稳定性变差，采用差速离心操作后，当测定蛋白质胶体 溶液经过差速离心后的蛋白质浓度，并计算各离心速度下对应的蛋白质浓度的标准方差s 时，则S变大，直至S出现变化速率最大点后，S的变化速率变小。在分散过程中蛋白质稳 定性变差速率最快的点，称为蛋白质分散稳定性变差的临界点（Critical Point，简称CP)。 本发明是通过测定蛋白质胶体的稳定性，来测定蛋白质在体系中的溶解度。
[0017] 本发明通过如下技术方案实现：
[0018] -种基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，包括如下步 骤：
[0019] (1)建立蛋白质浓度标准曲线：将蛋白质溶入溶剂体系中，采用光谱技术测量其 浓度，建立蛋白质浓度的标准曲线y = ax+b，其中y代表特征吸收峰值，X代表蛋白质浓度； a、b分别为标准曲线的斜率和截距，由标准曲线待定系数法确定；
[0020] (2)蛋白质分散样品的制备：根据分散过程蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情 况，从小到大等质量间隔称取蛋白质样品7~10个，样品质量分别记为 mi、Hl2、…Hli，其中 i = 7~10,每个蛋白质样本分别置于体积为V溶剂中，得到相应质量添加浓度为 c；^的样 品；将i个样品置于超声场中，在温度为10~60°C，搅拌速度为100~500r/min的条件下 搅拌分散，形成均一的胶体分散体系；
[0021] (3)差速离心：离心速度0~3000r/min之间等转速间隔取j个点，j = 6~10， 将步骤⑵得到的各样品在选定的j个速度下离心，得到（7~10) X (6~10)个样品；
[0022] (4)样品蛋白质浓度的光谱测定：分别取步骤⑶离心后得到的上清液，稀释到步 骤（1)标准曲线的蛋白质浓度范围内，采用光谱技术测量其特征吸收峰值，代入步骤（1)中 标准曲线方程，计算离心后分散体系中各样品对应的质量浓度e/，
[0023] (5)蛋白质溶解度的计算：将蛋白质样品质量添加浓度按由小到大的顺序纵 行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，根据步骤（4)中在不同离心速度下离心后 每个样品对应的质量浓度c/，求出每行c/的标准方差 Si，Si由式（1)计算：
【主权项】
1. 基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法，其特征在于包括如 下步骤： (1) 建立蛋白质浓度标准曲线：将蛋白质溶入溶剂体系中，采用光谱技术测量其浓度， 建立蛋白质浓度的标准曲线y = ax+b，其中y代表特征吸收峰值，X代表蛋白质浓度；a、b 分别为标准曲线的斜率和截距，由标准曲线待定系数法确定； (2) 蛋白质分散样品的制备：根据分散过程蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况，从 小到大等质量间隔称取蛋白质样品7~10个，样品质量分别记为…叫，其中i = 7~10,每个蛋白质样本分别置于体积为V溶剂中，得到相应质量添加浓度为的样品； 将i个样品置于超声场中，在温度为10~60°C，搅拌速度为100~500r/min的条件下搅拌 分散，形成均一的胶体分散体系； (3) 差速离心：离心速度0~3000r/min之间等转速间隔取j个点，j = 6~10,将步 骤⑵得到的各样品在选定的j个速度下离心，得到（7~10) X (6~10)个样品； (4) 样品蛋白质浓度的光谱测定：分别取步骤（3)离心后得到的上清液，稀释到步骤 (1) 标准曲线的蛋白质浓度范围内，采用光谱技术测量其特征吸收峰值，代入步骤（1)中标 准曲线方程，计算离心后分散体系中各样品对应的质量浓度c/; (5) 蛋白质溶解度的计算：将蛋白质样品质量添加浓度按由小到大的顺序纵行排 列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，根据步骤⑷中在不同离心速度下离心后每个 样品对应的质量浓度c/，求出每行c/的标准方差 Si，Si由式（1)计算：
(1) 式（1)中：7= ? 标准方差士随蛋白质样品质量添加浓度_由小到大呈一次指 j=1 J c, 数增加趋势，采用修正指数方程拟合得方程（2): S1 = nexp(cfJ It) (2) 式⑵中n、t为指数方程系数，由拟合方程待定系数法确定；根据指数方程特征，式 (2) 存在曲率最大点，曲率最大点为^变化速率最大处，表示该蛋白质胶体分散体系稳定性 恶化最快点，曲率最大点对应的浓度由式（3)得出，为蛋白质的溶解度： C = Hln^L- (3)。 1. V2?
2. 根据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方 法，其特征在于：步骤（2)中，体积V为50毫升。
3. 根据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方 法，其特征在于：所述蛋白质为玉米醇溶蛋白、大豆蛋白或溶菌酶。
4. 据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方 法，其特征在于：所述溶剂体系的溶剂为NaOH水溶液、乙醇水溶液或NaCl水溶液。
5.据权利要求1所述的基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方 法，其特征在于：所述根据分散过程蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况是将蛋白质在所 选溶剂体系进行超声辅助搅拌预分散，直至蛋白质加入到无法均匀分散，有明显析出，确定 蛋白质在所述溶剂体系中的溶解情况。
【专利摘要】本发明公开了基于超声分散、差速离心和光谱技术测定蛋白质溶解度的方法。该方法建立蛋白质浓度标准曲线；然后制备蛋白质分散样品：每个蛋白质样本分别置于体积为V溶剂中，得到相应质量添加浓度为的样品；再进行差速离心以及样品蛋白质浓度的光谱测定；最后进行蛋白质溶解度的计算：将蛋白质样品质量添加浓度按由小到大的顺序纵行排列，离心速度j按由小到大的顺序横向排列，求出每行的标准方差si，标准方差si随蛋白质样品质量添加浓度小到大呈一次指数增加趋势，计算出曲率最大点对应的浓度为蛋白质的溶解度。该方法测定蛋白质的溶解度，稳定、快速、准确。
【IPC分类】G01N1-38, G01N21-31
【公开号】CN104634750
【申请号】CN201510044738
【发明人】江燕斌, 魏东伟, 刘贵金, 霍伟智, 范嘉棋, 李炳辉
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月28日