一种分析微生物油脂组成的方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及一种分析微生物油脂组成的方法。
【背景技术】
[0003] 微生物油脂又称单细胞油脂，是由酵母、霉菌、藻类等真核微生物在一定条件下利 用碳源、氮源、辅以无机盐生产所得到的油脂。早在130多年前，人们就开始了对产脂微生 物的研究，经过漫长的研究开发，如今微生物油脂已经从学术性研究领域跨入婴幼儿奶粉 配方市场，成功地完成了从实验室研究到商业化的重要转变。
[0004] 微生物油脂中存在多种不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸主要包括单不饱和脂肪酸和 多不饱和脂肪酸，它们均对人体健康有很大益处。根据第一个双键位置的不同，多不饱和 脂肪酸可以分为ω-3、ω-6和ω-9三种类型。一些国家的科研机构建议，人们摄入的多 不饱和脂肪酸至少应占摄入总脂的3%，应提高膳食中ω-3型多不饱和脂肪酸的比例。其 中，二十二碳六烯酸（DHA)属ω-3型多不饱和脂肪酸，具有多种重要的生理功能，是视网 膜组织中细胞膜的组成成分，对婴幼儿视觉和神经系统的发育有至关重要的作用；同时它 在预防高血压、动脉硬化、关节炎以及癌症等疾病方面具有显著功效。花生四烯酸(ARA)属 于ω-6型多不饱和脂肪酸，是细胞膜的重要成分和前列腺素等生理活性物质的前体，具有 促进婴幼儿脑部发育，提高青少年记忆力等功效，还可以调节血脂血糖，抑制肿瘤。世界卫 生组织（WHO)和国际粮农组织委员会（FAO)在报告中推荐婴儿每日应摄食60 mg ARA (每 公斤婴儿体重)。如果膳食营养不均衡导致人体内ARA缺乏，这时需要适当补充ARA维持人 体正常生理活动。
[0005] 微生物油脂中主要成分是甘油酯，甘油酯分为甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯，一 般情况下甘油三酯占甘油酯总量的80%以上。通过LC-MS技术对甘油酯组成进行解析，可 以获得微生物代谢产物的数据库，建立检测油脂微生物中脂质变化的代谢分析平台，从而 调控细胞生长和脂质积累的内在代谢机制，为微生物油脂的工业化生产提供科学指导。
[0006] 甘油酯的分析方法国内外已经有相关的研究，如化学法（高碘酸法测单甘酯）、薄 层色谱（TCL)、气相色谱、高效液相色谱等分析方法。然而，化学法、薄层色谱只能简单定性， 无法定量分析甘油酯的组成；气相色谱法对甘油一酯、甘油二酯可进行定性和定量的分析， 而甘油三酯由于其分子量比较大，沸点比较高，因此甘油三酯的气相色谱分析是十分困难 的。
[0007] 孟祥河等人报道了使用正相高效液相色谱和蒸发光散射检测器测定和分离甘油 一酯、二酯和三酯化合物，然而，这种分析仅仅适用于油酸酯和亚油酸酯的分析和分离，不 能用于不同脂肪酸组成的甘油酯的分离。
[0008] 中国公开号为CN103743851A的专利研究了一种食用油中甘油三酯的单柱二维液 相色谱-质谱分析方法，该专利能检测甘油三酯，但是并没有提到甘油一酯、二酯的定性和 定量分析。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种新的、能全面分析油脂组成的分析微生物油脂组成的方 法。
[0010] 为实现上述目的，本发明的分析微生物油脂组成的方法，具体步骤包括：（1)将产 油微生物发酵，获得含有微生物油脂的菌体，从菌体中提取微生物油脂；（2)将微生物油脂 进样至质谱，对其进行全扫描，扫描范围为100-1000 ;(3)对各母离子进行MS2扫描，质谱条 件为DP:40-80，CE:35-50;(4)对样品进行中性丢失扫描，结合步骤（3)确定MRM方法， 对样品进行定性分析；（5)向样品中加入内标，以采集方式为MRM进行分段跑样，其中甘油 一酯和甘油二酯为一段，甘油三酯为另一段，通过对各自的离子色谱图进行积分，计算出各 组分的含量，进行定量分析；以上步骤中，使用以下仪器条件：色谱条件：进样量：20μ 1 ; 色谱柱：（：18色谱柱4.6父150,311111;流动相：六异丙醇，8甲醇，柱温201：，流速0.8 ml ,/mi η ;洗脱梯度为 Omin = 80%B ;6min = 80%Β ;6 ~13min = 60%Β ; 13 ~25min=80%B, 其中异丙醇和甲醇为色谱纯；质谱条件：AB 4500QTRAP串联四极杆离子阱质谱仪，高压放 电针电流：8μΑ，样品锥孔电压：5V，源温度：130°C，APCI加热器温度：500°C，脱溶剂气流 量：300L/h，锥孔气流量：100L/h ;仪器参数：离子源：Turbo V，电离模式：APCI正离子 模式；MRM参数：DP=40-80; CE=35-50,每对离子对扫描时间为3ms。
[0011] 本发明的分析微生物油脂组成的方法，采用LC-MS及C18反相柱，通过梯度洗脱可 以快速、高效、全面地对样品中的甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯的进行定性及定量分析。
【附图说明】
[0012] 图1为实施例ARA油脂中甘油一酯和甘油二酯LC-MS总离子流图； 图2为实施例ARA油脂中甘油三酯LC-MS总离子流图。
[0013] 以下结合具体实施例进一步说明本发明的内容。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1:使用高山被孢霉制备微生物油脂 a)孢子悬浮液准备：取高山被孢霉(保藏编号：CCTCC M2013419)。将菌种培养7天至 孢子成熟，然后进行液体深层培养。
[0015] b)种子瓶培养：将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA)培养基平板上的孢子和菌丝刮到装有 10毫升无菌水，5颗3毫米直径玻璃珠的锥形瓶中，锥形瓶置于200转/分钟的摇床上震荡 10分钟，然后将孢子悬液接入到种子瓶中，接种量10% (体积比)，种子瓶置于25°C，120转 /分钟的摇床上培养36小时，所述种子培养用到的培养基为：碳源为葡萄糖20 g/Ι ;氮源 为：酵母粉5 g/1 ;pH 5.5。
[0016] C)发酵瓶培养：种子瓶中菌浓达到15%，接入到发酵培养基中，接种量10% (体积 比)，发酵瓶置于25°C，120转/分钟的摇床上培养9天。所述发酵培养基为：碳源为葡萄糖 50 g/Ι ;氮源为：酵母粉 10 g/1 ;pH 5. 5。
[0017] d)微生物油制备：液体深层培养后分离并得到含有一定水份的菌体，取湿菌体 5g，放入研磨器中，同时加入5ml正己烧，充分研磨3min，过滤得到固相物转入到研磨器中 再次进行研磨，直到溶剂中无颜色，收集每次研磨后过滤分离得到的微生物油脂和溶剂的 混合液，脱溶，得到微生物油脂。
[0018] 实施例2:使用三孢布拉氏霉制备微生物油脂 a) 菌种活化：无菌环境下将三孢布拉霉正负菌株分别接种到斜面PDA培养基中， 置于培养箱内，27°C培养5d，待三孢布拉霉正负菌株分别长出孢子后，在无菌条件下，用无 菌生理盐水将斜面培养基中孢子刮洗下来，并配制成均匀的孢子悬液，使正负菌孢子悬液 的浓度分别达到：1〇 3~1〇6个孢子/mL，负菌103~106个孢子/mL; b) 种子培养：正负菌分别以孢子悬液的方式接种到种子培养基中，种子培养基装在 1000 mL的三角瓶中，装液量100~150mL，培养温度为27°C，转速220~250 r/min，正、负菌 培养时间为18~ 24小时，得到三孢布拉霉正负菌株种子液； c) 发酵培养：达到对数生长期的正负菌种子液按1:7~1:20的比例在无菌的条件下 混合，再以5%-25%的接种量接入发酵培养基中培养90~120h ;所述发酵培养基的配制方 法为：碳源为葡萄糖或淀粉；氮源为酵母粉和/或豆饼粉和/或大豆粉和/或玉米粉；无机 盐为磷酸二氢钾、磷酸二氢钾；植物油为：葵花籽油和/或豆油和/或棉籽油； d) 培养条件：温度：27°C ±1°C ;转速：250~500 r/min ;风量：l~3vvm ;溶氧控制：15% 以上；周期：90h~120h。过程中根据溶氧先调节通气量至最大，培养一段时间后，溶氧再次 降低至15%以下，此时调整罐压至最大，约0. lMpa~0. 16Mpa，此后逐步增加转速至最高500 r/min〇
[0019] e)微生物