34] (1)收集SLE病人血清样本，2000r/min离心10min。
[0035] (2)取上清，以ImL血清加入3mL PBS缓冲液的比例进行稀释，逐滴加入饱和硫酸 铵缓冲液，静置3h后，6000r/min离心。
[0036] (3)将步骤（2)获得的沉淀进一步经过sephadex G25脱盐，然后经过proteinG柱 子进一步纯化抗体，冷冻干燥得血清抗体，并保存于-20°C备用。
[0037] (4)取500微克血清抗体置于离心管中，加入5微升IOX变性剂、45微升超纯水， 混匀，再煮沸IOmin,然后离心。
[0038] (5)冷却至室温，加入5微升10XG7缓冲液、5微升10%NP-40缓冲液，加入1微升 PNGase F酶，于37°C下过夜。
[0039] (6)然后干燥样品，过SEP-C18柱。样品进一步经过真空干燥以后，冰浴下加入300 微升新鲜配制的还原溶液--NaBH 4溶液（10mg/ml inO. OlNNaCl )，室温下静置过夜。
[0040] (7)冰浴下，加入几滴乙酸终止反应，然后升温至室温，并加入3ml乙醇干燥样品。
[0041] (8)为了去除样品中的硼酸盐，分别、依次向上述干燥的样品中加入3ml下列试 剂 :a、l%乙酸：甲醇，b、甲苯，c、l%乙酸：甲醇，d、甲苯，e、l%乙酸：甲醇，重复进行加入试 剂-干燥的步骤，最终得到的干燥样品即为从血清抗体中切割下来的糖链。
[0042] (9)用Iml水溶解切割下来的糖链。
[0043] (10)准备PGC预装柱(需要亲和层析装置)，分别、依次向预装柱中加入下列试 剂 3ml :a) IM NaOH ;b) HPLC 水；c) 80%ACN 水溶液（内含 0· 1%TFA ;d) 25%ACN 水溶液（内含 0. 05%TFA ;e) 25%ACN ;f)水，进行洗柱；再6-8ml用水平衡柱子。
[0044] (11)向步骤（10)所得柱子上样步骤（9)所得样品，加入8-lOml水洗脱柱子，以 去除杂质和盐分；然后加入3ml25%CAN洗脱下中性的糖链(如果洗脱的糖是酸性的，需要加 3ml25%ACN水溶液（内含0. 1%TFA));真空干燥样品，加入甲醇溶解样品，进行一级质谱分析， 所得一级质谱图如图1所示。
[0045] (12)将一级质谱分析中相对丰度较大的峰所对应的糖链，进行多级质谱结构鉴 定，以确定所对应糖链的具体结构。
[0046] 试验结果：
[0047] (1)经过多级质谱鉴定，图1中三个峰所代表的结构分别如下：
[0048] m/z909. 5所代表的结构是H6N2 (H为六碳糖，包括半乳糖和甘露糖，N代表葡萄糖 胺)，即含有葡萄糖胺2个，甘露糖6个；其二级质谱图如图2所示；
[0049] m/zl443的结构为H3N10,进一步可以鉴定为10个甘露糖，3个葡萄糖胺；其二级 质谱图未显示；
[0050] m/zl446所代表的结构为H8N4F1 (F为岩藻糖)，进一步鉴定为6个甘露糖，2个半 乳糖，4个葡萄糖胺，1个岩藻糖；其二级质谱图未显示。
[0051] 此3种N糖都是1?岩澡糖基化N糖，其具体的结构分别如表1所不。
[0052] 表1、多级质谱鉴定出的三种N糖的结构
【主权项】
1. 一种特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂在制备用于系统性红斑 狼疮的诊断和/或预后评估的诊断工具中的应用。
2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于,所述血清抗体为血清IgG型抗体。
3. 根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述高甘露糖型N糖链为结构式分别 如I、II和III所示糖链的任意一种或几种的混合物； 其中，结构式I为： Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man-(Man-Man)Man-Man-Man ； 结构式II为： Asn-GlcNAc-GlcNAc-Man- (Man) 2 (Man)2G1cNAc(Man) 3 (Man) 2 ； 结构式III为： Asn-GlcNAc (Fuc) -GlcNAc-Man- (Man) 4 (GlcNAc-Gal) (Man-GlcNAc-Gal)。
4. 根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，通过免疫测定法检测血清抗体 中高甘露糖型N糖链的水平； 优选地，所述免疫测定法为酶免疫测定法、免疫比浊测定法、乳胶免疫凝集法、电化学 发光法或荧光法； 更优选地，所述免疫测定法为酶联免疫吸附测定法。
5. 根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，所述特异性检测血清抗体中高 甘露糖型N糖链水平的试剂包括特异性识别高甘露糖型N糖链的抗体或配体。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体或抗原结合片段； 优选地，所述抗体为鼠抗人单克隆抗体。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的应用，其特征在于，所述诊断工具为诊断试剂、试剂 盒、蛋白芯片或免疫检测试纸。
8. 根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，通过质谱法检测血清抗体中高 甘露糖型N糖链的相对丰度。
9. 根据权利要求1-8任一项所述的应用，其特征在于，通过检测待测个体的血清抗体 中高甘露糖型N糖链的水平，将其与相同检测条件下的正常个体的血清抗体中高甘露糖型 N糖链水平相比的增高，诊断为患有系统性红斑狼疮。
10. -种系统性红斑狼疮的诊断工具，其特征在于，包括特异性检测血清抗体中高甘露 糖型N糖链水平的试剂； 优选地，所述诊断工具为诊断试剂、试剂盒、蛋白芯片或免疫检测试纸； 优选地，所述特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂为特异性识别高甘 露糖型N糖链的抗体或配体。
【专利摘要】本发明涉及一种系统性红斑狼疮的诊断标志，具体公开了一种特异性检测血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的试剂在制备用于系统性红斑狼疮的诊断和/或预后评估的诊断工具中的应用。所述血清抗体中高甘露糖型N糖链水平的增高与系统性红斑狼疮的发生密切相关，可用于系统性红斑狼疮的早期诊断和/或预后评估，进而用于指导系统性红斑狼疮的治疗。
【IPC分类】G01N33-577, G01N33-68, G01N30-72, G01N30-06
【公开号】CN104655852
【申请号】CN201310596482
【发明人】吴忠福, 李云森
【申请人】苏州中赢医疗科技有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年11月21日