一种检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽药残留检测技术领域，特别是检测鸡肉组织中孕酮的酶联免疫试剂盒。
【背景技术】
[0002]孕酮亦称为黄体酮、孕留酮、黄体留酮、黄体激素、助孕激素、助孕素或助孕酮是一种涉及女性月经周期、妊娠和对人类还又其他动物的胚胎有影响的类固醇。孕酮是一种女性荷尔蒙，参与人类与其他动物的雌性月经周期，支援怀孕与胚胎形成。孕酮是属于一类称为孕激素的荷尔蒙，也是人类最重要的孕激素。激素类药物可提高畜食的饲料转化率，进而达到增重的目的，但因孕酮在体内残留会导致一系列问题，如性征变化，早熟等，对儿童和青少年作用更为明显。目前，激素类物质已被大部分国家禁止在养殖业中使用，并不得在食品中检出。但国内尚没有鸡肉中孕酮残留检测的相关报道，因此，有必要建立一种鸡肉组织中孕酮残留的检测技术。
[0003]酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法。
【发明内容】
[0004]为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。
[0005]本发明检测孕酮的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、孕酮标准品、孕酮抗体工作液、孕酮酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。
[0006]本发明检测孕酮的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤:酶标板的制备、孕酮标准品的制备、孕酮抗体工作液的制备、孕酮酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。
[0007]其进一步特征在于:所述的酶标板经由孕酮抗原包被制备，具体步骤是将孕酮半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将孕酮包被抗原稀释成1:40000比例，100 μ L/孔，37°C避光孵育2 h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150 μ L/孔，37°C放置1.5 h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4°C条件下保存。
[0008]孕酮标准品浓度分别为O μ g/kg、0.1 μ g/kg、0.3 μ g/kg、0.9 μ g/kg、2.7 μ g/kg、8.1 μ g/kg。
[0009]所述孕酮抗体工作液是采用孕酮人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1:60000比例制备。
[0010]所述孕酮酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1:2000比例,所述底物液A为含有0.5 mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2 mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1 mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含 0.5% 吐温-20，0.1 mol/L 的 PBST，pH 值范围 7.0-7.5 之间。
[0011]检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤:
(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；
(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20?25°C)平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；
(3)取包被有孕酮抗原的酶标板，加标准品/样本50μ L/孔到对应的微孔中，加入孕酮酶标二抗工作液，50 μ L/孔，然后加入孕酮抗体工作液，50 μ L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25 °C避光环境中反应30 min ；
(4)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液260μ L/孔，充分洗涤4飞次，每次间隔10 S，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；
(5)加入底物液A50 μ L/孔，底物液B 50 μ L/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25°C避光环境中反应15?20 min ；
(6)加入终止液50μ L/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值(请在5 min内读完数据)；
(7)以的标准品浓度(ppb)的对数为横坐标，标准品百分吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中孕酮的含量。
[0012]其中，所述待测样品用以下方法进行预处理:
a.准确称取2.0±0.02g匀浆样品至50 mL离心管中；
b.先加入5mL乙酸乙酯,润旋仪充分振荡混勻1min；
c.5000 r/min 离心 10 min ；
d.取上清液ImL于5(T60°C氮气流下吹干；
e.加入ImL正己烷(脂肪含量高的样品可加入2mL正己烷)，充分涡动10 S，再加入I mL样品稀释液,低速润动10 s ；4000 r/min,离心5 min,完全弃去上层正己烧及中间层杂质；
f.取下层50PL用于分析。
[0013]本发明检测孕酮的酶联免疫试剂盒及其检测方法的测定原理:样品中的孕酮与酶标板上固定的抗原特异性竞争抗体，加入酶标二抗，与抗体反应，通过酶催化显色剂显色，根据显色的深浅来判断样品中孕酮的含量。如果样品中的孕酮含量少，显色深；反之，则显色浅。本发明的试剂盒检测方法操作简便，检测灵敏、准确、快速，适用于大批量样品的快速检测。
【具体实施方式】
[0014]孕酮蛋白质偶联物的制备: 采用琥珀酸酐法得到带羧基的孕酮半抗原衍生物，之后取0.05 mmol与载体蛋白BSA按10:1的结合比混合在0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液(CBS)中，然后加入0.15 mmol碳二亚胺，搅拌置室温反应24 h，最后于0.2 mol/L pH 7.6的PBS缓冲液中透析两天，除去未反应的半抗原，将得到的蛋白质偶联物溶液于_20°C保存备用。
[0015]孕酮抗体的制备:
选用健康成年纯种BALA/C小鼠，取与蛋白质偶联制备的免疫抗原SOyg与等量完全弗氏佐剂混合采用腹腔注射进行初次免疫，之后每隔3周用相同剂量免疫抗原加等量不完全弗氏佐剂采用腹腔注射进行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾静脉采血测定抗血清效价至一定滴度后，用相同剂量不加佐剂进行末次免疫，3天后取脾制备脾细胞悬浮液与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出所需要的杂交瘤细胞系进行克隆化，选择处于对数生长期的杂交瘤细胞进行冻存，用于腹水制备，先腹腔注射0.5 ml液体石蜡于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射IXlO6个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后可产生腹水，待腹水尽可能多时用注射器抽取腹水，反复收集数次，4000 rpm离心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸铵法纯化腹水对单克隆抗体进行纯化，冷冻干燥得冻干粉后于-20 °C保存备用。
[0016]制备包被有孕酮包被抗原的酶标板:
包被抗原是将孕酮半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的，用0.05 mol/LpH 9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将孕酮抗原稀释成1:40000比例，100 μι/孔，37°C放置2 h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液300 PL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25°C)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封后置4°C下保存。
[0017]孕酮标准品配制浓度分别为O μ g/kg、0.1 μ g/kg、0.3 μ g/kg、0.9 μ g/kg、2.7μ g/kg、8.1 μ g/kg。
[0018]孕酮抗体工作液的制备:采用孕酮人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1:60000比例制备。
[0019]孕酮酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释