一种鸡传染性贫血病毒检测胶体金试纸条的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种鸡传染性贫血病毒检测胶体金试纸 条。
【背景技术】
[0002] 鸡传染性贫血病（CIA)是由鸡传染性贫血病毒（CIV)引起的以雏鸡再生障碍性贫 血、全身淋巴组织萎缩、皮下肌肉出血等为特征的一种免疫抑制性传染病。CIA引起鸡群的 死亡增加、成活率和体增重降低。又因免疫器官损伤引起严重的免疫抑制，降低鸡群的抵抗 力，增加鸡群对各种病原的易感性，降低鸡群对各种常规疫苗免疫接种效果，给其他疾病的 防治带来很大困难，同时会造成继发感染，给养鸡业带来很大的损失。CIA自1979年Yuasa 等在日本首次报道以来，德国、瑞典、英国等相继分离到CIV。我国于1992年首次分离到 CIV，近年来，在某些地区本病的发生有增加趋势。
[0003] 目前，诊断CIA的方法包括：病毒分离鉴定、血清学诊断（包括病毒中和试验 (NV)、间接免疫荧光试验（IFA)、酶联免疫吸附试验（ELISA))和生物技术方法诊断（包括 PCR技术、核酸探针技术）等。病毒分离鉴定虽然是诊断CIA的有效手段，优点是特异性强， 但费时费力，容易延误该病的治疗；免疫荧光、ELASA等血清学诊断方法虽然具有微量、特 异、快速、准确的优点，但需要比较完备的仪器设备和经验丰富的技术人员来操作和判断结 果，对于基层兽医站或鸡场等不适用。PCR及核酸探针的诊断更需要有特殊的仪器和药品， 且技术含量高，很难在基层推广应用。因此，迫切需要建立一种简单、快速，灵敏，廉价，适合 于基层应用的鸡传染性贫血病毒的快速检测方法。国内外己研制出了鸡传染性贫血病病毒 抗体的ELISA快速检测试剂盒，此试剂盒是检测血清中鸡传染性贫血病病毒抗体，但在用 这种诊断试剂盒的操作过程中，一些试剂需要现场配制，此试剂盒的使用也显得不太方便。 国内梁智选进行过鸡传染性贫血病毒抗体斑点免疫胶体金渗滤试验检测方法，是对血清中 鸡传染性贫血病病毒抗体的检测，但是存在硝酸银对环境污染的危险。迄今为止，还未见有 关鸡传染性贫血病毒胶体金快速检测试纸条方法建立的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明针对现有技术对鸡传染性贫血病毒快速检测的技术缺陷，旨在提供一种鸡 传染性贫血病毒检测胶体金试纸条，提供了一种简单、快速、廉价，不需任何仪器，特别适合 于基层应用检测鸡传染性贫血病毒（CIV)的新方法。既可以用于鸡传染性贫血病（CIA)的 诊断，也可以用于CIA的检疫，具有广阔应用前景，对于有效控制CIA的发生和流行具有重 要意义。
[0005] 本发明具体通过以下技术方案实现：
[0006] -种鸡传染性贫血病毒检测胶体金试纸条，包括鸡抗CIV金标抗体玻璃纤维膜、 硝酸纤维膜、吸水垫和PVC底板，其中硝酸纤维膜粘贴于PVC底板中央，玻璃纤维膜由样品 垫与结合垫组成，结合垫端粘贴在硝酸纤维膜划有T线的一端，并重叠0. 2cm，硝酸纤维膜 划有C线的一端粘贴有吸水垫，并重叠0. 2cm。
[0007] 所述的硝酸纤维素膜通过以下方法制备：硝酸纤维素膜剪成0. 5cmX 2. 5cm，用包 被液将鸡抗CIV抗体稀释成2 μ g/cm2在硝酸纤维素膜的一端划线作为检测线T线，用包 被液将兔抗鸡IgG抗体稀释成1. 5 μ g/cm在硝酸纤维素膜另一端划线作为检测线C线，两 线间距0. 5cm，室温放置15min，待抗体完全吸附于膜上后，移至封闭液封闭30min，然后用 0.01m〇l/L磷酸盐缓冲液（pH 7.4)漂洗三次，2min/次，置于37°C烘箱中干燥，密封，4°C保 存。所述的鸡抗CIV抗体和兔抗鸡IgG抗体的稀释度为1 : 2。
[0008] 所述的鸡抗CIV金标抗体玻璃纤维膜通过以下方法制备：将金标抗体原液用金 标抗体稀释液进行1 : 2稀释，按4yg/cm2喷涂于玻璃纤维膜结合垫端，喷涂的面积为 0· 5cmX0. 5cm，37°C吸附lh，然后浸泡在封闭液中封闭0· 2cm，于37°C温箱中干燥。4°C保存 备用。
[0009] 所述的封闭液为：BSA3g、蔗糖2. 5g、吐温20 100 yL、PVP-K30 0. 3g，叠氮钠 0.0 lg，加入0. 01mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8. 5)液溶解并定容至100mL。
[0010] 所述的玻璃纤维膜通过以下预处理方法得到：玻璃纤维膜剪成〇. 5cmX3. 0cm，用 pH8. 5的Tris-HCl缓冲液将玻璃纤维膜漂洗三次，5min/次，将漂洗好的玻璃纤维膜37°C烘 干，用含有2% BSA、2.5%蔗糖、1%吐温20、0.3% PVP-K30以及0.02%叠氮钠的O.Olmol/ L磷酸盐缓冲液（pH 7.4)封闭，于37°C温箱中干燥。
[0011] 本发明鸡抗CIV金标抗体通过以下方法制备：
[0012] 1)取20mL胶体金，用0· Imol K2COJ节胶体金溶液pH至8. 5,将胶体金溶液 3500r/min离心15min，弃沉淀，在磁力搅拌下，向胶体金溶液中缓慢加入221. 076 μ g/mL鸡 CIV抗体至终浓度为44. 22ug/mL，持续搅拌30min ;
[0013] 2)加10% BSA牛血清白蛋白至终浓度1%，室温搅拌IOmin ;
[0014] 3)加 10% PEG 20000 至终浓度 0· 2%，室温搅拌 IOmin。
[0015] 4)将金标抗体溶液4°C 3500rpm离心20min，上清液4°C 12000rpm离心lh，沉淀 用金标抗体保存液稀释至原体积，重复离心2次，沉淀用金标抗体保存液稀释为原体积的 1/20,用0. 45 μ m滤膜过滤，置4°C冰箱保存备用。
[0016] 所述的金标抗体保存液为：BSA 0· lg，PEG20000 0· 05g，NaN3 0· 02g，用 30mL 0.0 lM pH7. 4的磷酸盐缓冲液溶解并定容至100mL。
[0017] 本发明所述的胶体金通过常规柠檬酸三钠还原法制备胶体金，具体为：将氯酸金 (HAuCl 4)溶解于三蒸水中配制成0. 01 %的水溶液；取0. 01 %的HAuCl4水溶液IOOrnl加热 至沸，搅动下准确加入1%柠檬酸三钠（Na3C6H 507 *2H20)水溶液2ml。继续加热煮沸15min。 此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变灰色，续而转成黑色，随后 逐渐稳定成橙红色。冷却至室温后用三蒸水恢复至原体积。同样方法制备三次。4°C备用。
[0018] 本发明的有益效果为：检样用量极小，可以低至2-3滴；简便，一步操作，无需任 何仪器，非常适合现场使用；安全可靠，没有有害物质（如放射性同位素、邻苯二胺、硝酸银 等）的参与，不会造成环境污染；检测所需时间短，几分钟即可出结果；由于抗原抗体反应 的的特异性，所以灵敏性、特异性较高；结果稳定，颜色不受时间和光照的影响，实验结果可 长期保存；检测成本低，如果批量生产，成本仅需5-8元。
【附图说明】
[0019] 图1是本发明试纸条结构示意图；
[0020] 图2是本发明试纸条的俯视图；
[0021] 图3是本发明实施例试纸条的特异性检测；
[0022] 图4是本发明实施例试纸条的灵敏性检测；
[0023] 图5是本发明实施例试纸条的稳定性检测；
[0024] 图6是本发明实施例试纸条对感染CIV鸡的实例检测；
[0025] 图7是感染组PCR扩增检测结果；M :DNAMaker DL2000 ; 1-5 :心、肝、脾、肺、骨髓；
[0026] 图8是对照组PCR扩增检测结果；M :DNA Maker DL2000 ;1、2 :阳性对照；3-7 :心、 肝、脾、肺、骨髓；8:空白；
[0027] 附图1、2中标示说明：1样品垫；2结合垫；3硝酸纤维膜；4检测线；5质控线；6吸 水垫；7PVC底板。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施 例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示 的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明 的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
[0029] 实施例1
[0030] 一种鸡传染性贫血病毒检测胶体金试纸条通过以下方法制备：
[0031] 一、鸡抗CIV抗体的制备、纯化、检测
[0032] 1、鸡抗CIV抗体的制备
[0033] SPF鸡用鸡CIV弱毒苗（德国罗曼动物保健有限公司）免疫4次，采血，制备血清 抗体。
[0034] 2、鸡抗CIV血清抗体的纯化
[0035] 用辛酸-饱和硫酸铵法和抗原纯化抗体法先后对血清抗体进行两次纯化。
[0036] 常规辛酸-饱和硫酸铵法：
[0037] 取血清3ml，加入0. 06M pH4.