合图。
[00巧]3. 3实验条件的优化
[0056] 为了使开发出的传感器实现最优的工作状态，一些实验参数需要进行优化，包括 适配体的浓度、反应时间、pH和检测温度。为了研究适配体浓度的影响，我们在NPG/GCE表 面固定不同浓度化1，0. 5, 1. 0, 2. 0, 5. 0, 8. 0, 10. 0, 12. 0 uM)的适配体。得到的aptamer/ NPG/GCE探针被浸于含有50 y M BPA的PBS溶液中。接着，通过DPV扫描结果来观察不同浓 度的适配体对传感器性能的影响。结果显示在低浓度范围内，响应电流随着适配体浓度的 增大明显增大。但是，当适配体浓度超过5.0 uM后，响应电流不再有明显的增大。该是因 为电极表面用于固定适配体的活性位点已经达到了饱和。因此，在制备该电极的过程中，适 配体的最佳浓度为5. 0 y M。
[0057] 为了研究适配体探针与BPA的反应时间对检测结果的影响，aptamer/NPG/GCE探 针分别在含有50yM BPA的PBS溶液中浸没不同时间（0-35分钟），再用DPV测试捕获到的 BPA，便可获得传感器的响应电流和反应时间的关系。结果显示响应电流在反应3min W后 出现，然后随着反应时间的增加逐渐增大。但是在30min后由于能捕获BPA的适配体位点 趋于饱和，峰电流不再出现明显的增大。因此，aptamer/NPG/GCE与BPA溶液最佳的反应时 间应为30min。
[0058] 接下来，为了研究测试溶液的抑对传感器响应电流的影响，我们将捕获了 BPA的 探针置于不同抑巧.5到8.0)的PBS溶液中进行DPV扫描。在抑为5. 5到7. 5的范围内， 电流值随着抑值的增大而增大，当抑值大于7. 5后，电流值随着抑值的增大而减小。最 大响应电流出现在抑为7, 5的实验条件下，因此本实验的所有工作都是在抑为7. 5的PBS 溶液中进行的。
[0059] 另外，检测温度（15到50°C )对反应电流的影响也被考虑到。当检测温度从15°C 上升到40°C的过程中，峰电流显著增大。但是一旦温度超过40°C，峰电流值急剧下降。该 一显著的下降应该是由于NPG结构内部的热效应导致的。考虑到NPG的稳定性，30°C被选 作最佳检测温度。
[0060] 3. 4BPA 的检测
[0061]图 4.处
[0062] 图4. (A) aptamer/NPG/GCE传感器对不同浓度的BPA溶液的DPV检测结果（(a) 0， 化）0. 1，（C) 1. 0,（d) 10. 0,（e) 20. 0,（f) 50. 0,（g) 100. 0,化）150.0 nM);炬）aptamer/NPG/GCE 传感器检测不同浓度BPA得到的标准曲线。
[0063] 在优化的实验条件下，aptamer/NPG/GCE探针被用来检测PBS溶液中不同浓度的 BPA (0-150.0 nM) "DPV扫描结果如图4. A所示，峰电流值随着BPA浓度的增大而逐渐增大。相 对应的标准曲线在0.1 nM到lOOnM BPA浓度范围内显示了非常好的线性关系（见图4. B)。 该线性关系可W用方程 Ip(yA) = (0.047 + 0. 007) + (0. 017 + 0. 00036KBPA] (nM)表示，其 相关系数为0.998。该传感器的灵敏度为0.017 + 0. 00036 uA/nM。基于五组空白实验数据 的标准偏差（置信水平为95%，k = 3，n = 5)，可计算出检测限为0. 056 + 0. 004nM BPA。 该传感器的线性范围和检测限与之前报道的电化学BPA传感器进行了比较。我们发现该传 感器的检测限低于之前大多数的检测方法。而且值得一提的是，和用纳米金颗粒修饰的电 化学传感器相比较巧引[17]，该传感器的检测限降低了接近100倍。该一结果归功于NPG 双向连续的纳米结构，大大提高了传感器的电传导性。
[0064] 3. 5选择性，重复性和稳定性
[0065]图 5.处
[0066] 图5.aptamer/NPG/GCE传感器对不同分析物的DPV扫描结果图。
[0067] 为了研究该传感器的选择性，我们选取了一些与BPA的结构、官能团相似的化合 物进行实验，例如苯酪、对苯二酪、4, 4' -二哲基联苯和双酪B。aptamer/NPG/GCE探针分别 用来检测lOOnM上述的化合物和lOnM BPA。图5.显示了 DPV扫描结果，对于苯酪、对苯二 酪、4, 4'-二哲基联苯和双酪B来说，该传感器并未出现明显的氧化还原峰。但是，该传感器 检测lOnM BPA时出现了非常明显的氧化峰。该传感器的出色的选择性来自于适配体能可 靠地特异性识别BPA。
[0068] 为了考究该传感器探针检测的重复性，同一批制得的五支探针被用来检测lOnM BPA溶液。该批传感器的检测结果的相对标准差巧SD)为6. 2%，显示了良好的检测重复性。
[0069] 通过先后对同一浓度BPA溶液的检测来评估该传感器探针的工作稳定性。首先， 在相同条件下制得一批aptamer/NPG/GCE传感器探针。接着，用其中的S支探针来检测 lOnM BPA溶液，其检测平均值作为参考基准。其余的电极储存于4°C条件下，每隔十天取立 支来检测同一浓度的BPA。历经两个月，所得检测结果并没有随时间不同发生明显变化，该 显示了该探针的稳定性是令人满意的。
[0070] 3. 6实际样品的分析
[ocm] 表1.对注入定量BPA的稀释五倍的人体血清样本的检测结果
[0072]
【主权项】
1. 一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器，包括对电极、参比电极和工作 电极，其特征在于：所述的工作电极为表面修饰了双酚A适配体/纳米多孔金的玻碳电极， 制备方法如下： 1) 将玻碳电极GCE用氧化铝粉末在麂皮革上研磨至镜面抛光度，超声洗涤后，再分别 用超纯水和乙醇浸洗； 2) 将脱合金法制得的纳米多孔金NPG平铺到GCE表面，得到的NPG/GCE ; 3) 将活化后的BPA适配体滴至NPG/GCE上，静置10-12h，使适配体通过S-Au键固定在 NPG上，即得aptamer/NPG/GCE传感器探针。
2. 根据权利要求1所述的双酚A传感器，其特征在于：所述的对电极为铂电极，所述的 参比电极为银/氯化银电极。
3. -种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器的制备方法，其特征在于，具体 步骤如下： 1) 将玻碳电极GCE用氧化铝粉末在麂皮革上研磨至镜面抛光度，超声洗涤后，再分别 用超纯水和乙醇浸洗； 2) 将脱合金法制得的NPG平铺到GCE表面，得到的NPG/GCE ; 3) 将BPA适配体滴至NPG/GCE上，静置过夜，即得aptamer/NPG/GCE传感器探针，并用 TE缓冲液洗涤后置于4°C的冰箱内储存待用。
4. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述将NPG通过物理吸附作用平 铺到GCE表面。
5. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述活化后的BPA适配体的滴加 量为0? 1~12yL。
6. 如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述BPA适配体的活化方法为 取100 y L、5. O y M适配体与10 y L、0. 5mM二硫苏糖醇充分振荡混合，活化15分钟，然后用 100 y L乙酸乙酯对未反应的二硫苏糖醇及其它副产物进行萃取分离，萃取三次，即得。
7. -种应用权利要求1或2所述的双酚A传感器检测双酚A浓度的方法，其特征在于， 包括以下步骤：将生物传感器浸入待测样品中，根据相应电流值与双酚A浓度的定量关系， 确定待测样品中双酚A的浓度。
【专利摘要】本发明公开了一种基于适配体修饰的纳米多孔金的双酚A传感器及方法，对双酚A(BPA)进行了高灵敏度、高选择性地直接电化学检测。将金银合金薄膜置于浓硝酸中腐蚀掉其中的银，得到NPG膜。用NPG修饰玻碳电极，然后再修饰上BPA的适配体，制得传感器。NPG对BPA的氧化还原反应表现出优异的电化学催化活性，从而确保了传感器的高灵敏度。固定在NPG上的适配体大大提升了该传感器的选择性。被适配体捕获的BPA在0.35V/0.28V处(相对于银/氯化银电极)显示出氧化还原峰。本实验对重要的实验参数进行了优化。该检测方法的线性检测范围为0.1nM到100nM，检测限为0.056±0.004nM。值得一提的是，该传感器已被成功应用于人血清样本中BPA的检测。
【IPC分类】G01N27-30, G01N27-26
【公开号】CN104749233
【申请号】CN201510149951
【发明人】朱烨, 闫妍, 周楚青, 闫旭鹏
【申请人】山东大学
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月31日