一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生elisa检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种较大范围，具体是一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生 ELISA检测方法。
【背景技术】
[0002] 孔雀石绿（Malachite Green，MG)是一种三苯甲烧类物质，又称为盐基块绿、碱性 孔雀绿、孔雀绿、碱性绿、中国绿或苯胺绿，为具有金属光泽的深绿色结晶状固体。孔雀石绿 曾经在许多行业均有应用，如皮革业、食品染色业、制陶业、印染业等。由于MG对于水生动 物疾病的防疫和治疗可以起到很好的疗效，从1936年开始便广泛应用于水产养殖中。孔雀 石绿也可用作杀菌剂，对于防止霉菌在鱼卵中生长以及真菌的二次污染有较好的效果。但 是，孔雀石绿存在高毒、高残留和高致癌、诱变的缺点。我国在2002年5月已将其定为水产 生物违禁用药，但由于其价格低廉，而且杀菌效果显著，目前仍有不法商户还在使用。由于 其添加量很少就可以达到很好的杀菌效果，给检测水产品中的MG带来一定的难度。因此， 建立MG残留的检测方法十分迫切并且具有重要的现实意义。
[0003] 目前MG的检测方法主要有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、以及气相色 谱-质谱联用法。这些方法在测定和分析水产品中孔雀石绿的残留都具有结果可靠、灵敏 度高、选择性高、重复性好的优点。但是这些方法在样品前处理过程都存在繁琐复杂、耗时 等不足，而且设备昂贵，检测成本高；不仅需要消耗大量的溶剂和大量的时间，还容易造成 二次污染，影响检测结果的准确性。因此，发展一种快速高效的MG的检测方法对控制水产 品质量安全具有重要意义。
[0004] 分子印迹聚合物具有构效预定性、特异识别性和广泛适用性的显著特点，而酶联 免疫法检测快速、灵敏。将二者结合起来，以合成的分子印迹聚合物作为仿生抗体，不仅具 有选择特异性，而且可以重复利用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方 法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] 一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，具体步骤如下：
[0008] (I)Fe3O4的合成：称取0· 30~0· 36g聚乙二醇，加入7~9mL超纯水，超声直至聚 乙二醇完全溶解，称取2. 00~2. 06g FeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取1. 4~ I. 6g FeCl^入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0. 4~0. 6mL0.1mol L η稀盐酸，通氮 除氧12~18min，60°C水浴下边搅拌边迅速加入55~65mL氨水，调转速至1500r mirf1，反 应lh，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱4~6次，真空冷冻干燥后保存备用；
[0009] (2)预聚合溶液的配制：将0· 08~0· 12g Fe3O4加入0· 8~I. 2mL油酸中并用玻 璃棒搅拌均匀，加入8~12mL 0. 05mol L-1MG氯仿溶液和43~170 μ L功能单体，在400r mirT1的转速下搅拌25~35min，4°C下静置I. 5~2. 5h形成A液；
[0010] (3)预乳化溶液的配制：将Span-80和tween-80各0· 4~0· 6mL加入22~28mL 超纯水中，再加入475~950 μ L交联剂，在400r mirT1下搅拌25~35min形成B液；
[0011] (4)MG磁性分子印迹聚合物的制备：在400r mirT1转速搅拌下，将A液缓慢加入到 B液中，氮气除氧18~22min，将温度升到60°C，加入0. 08~I. 2g偶氮二异丁腈引发聚合 16~20h，反应结束后用22~28mL甲醇破乳，抽滤后得到粗孔雀石绿磁性分子印迹聚合 物，产物用体积比为8~10:1的甲醇-乙酸混合液索氏提取至无孔雀石绿模板洗出，再用 甲醇洗至中性，最后用超纯水洗去甲醇，真空冷冻干燥后备用；
[0012] (5)半抗原的合成：将850~950mg 4-甲酰基苯甲酸、2. 2~2. 6mL N，N-二甲基 苯胺和2. 2~2. 6g无水ZnCl2溶解在60mL无水乙醇中，氮气保护下加热回流22~26h，室 温冷却后，加入28~32mL甲醇，滴加氨水至沉淀产生，过滤后用水冲洗，真空中用KOH进行 干燥得到羧基化的隐性孔雀石绿；三氯甲烷溶解羧基化的隐性孔雀石绿，加入四氯对苯醌、 冰醋酸25°C下搅拌反应1~2h，反应产物经等体积的三氯甲烷-四氯甲烷洗涤2~3次， 真空干燥可获得半抗原羧基化孔雀石绿粉末；
[0013] (6)酶标抗原的合成：将1. 8~2. 2mg半抗原羧基化孔雀石绿CMG粉末溶于0. 8~ 1. 2mL 20 % N，N-二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入1.8~2. 2mg mL-1 EDC 32~ 24 μ L，调pH 4. 5~5. 0,反应18~22min后，迅速加入7. 0~8. Omg辣根过氧化物酶HRP， 调pH至7. 8~7. 2,室温反应2. 5~3. 5h得到CMG-HRP偶联物，20 °C冷冻保存；
[0014] (7)检测：取18~22mg磁性分子印迹聚合物置于IOmL离心管中，加入浓度为 0· 1~10000 μ gl/1的MG-PBS缓冲溶液2. 8~3. 2mL，然后立即加入稀释度为I :1400~ 1600的酶标抗原溶液2. 8~3. 2mL，不加 MG溶液的离心管为对照组，冰浴振荡吸附1. 5~ 2. 5h ;弃上层溶液，每管加入140~160 μ L底物显色液，显色25~35min后每管加入45~ 55 μ L终止液，立即在酶标仪上读数，计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率。
[0015] 作为本发明进一步的方案：所述步骤（2)中的功能单体为α -甲基丙烯酸、丙烯酰 胺或丙烯酸。
[0016] 作为本发明进一步的方案：所述步骤（3)中的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、 二乙烯苯或三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯。
[0017] 作为本发明进一步的方案：所述步骤（7)中的底物显色液为邻苯二胺。
[0018] 作为本发明再进一步的方案：所述步骤（7)中的终止液为2mol Γ1的硫酸。
[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明磁性分子印迹聚合物具有特异识 别性和使固液快速分离的显著特点，而酶联免疫法检测具有快速和灵敏的特点，将二者结 合起来，以合成的分子印迹聚合物作为仿生抗体，不仅具有选择特异性，而且可以重复利 用。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明中磁性分子印迹聚合物电镜扫描图；
[0021] 图2为本发明中磁性分子印迹聚合物傅里叶红外光谱图；
[0022] 图3本发明中为磁性分子印迹聚合物磁滞回线；
[0023] 图4和图5为本发明中磁性分子印迹聚合物热重图；
[0024] 图6为本发明中酶标抗原紫外光谱图；
[0025] 图7为本发明中半抗原CMG红外光谱图；
[0026] 图8为本发明中MG直接竞争ELISA标准曲线；
[0027] 图9为ELISA和HPLC法对样品中MG测定结果的一致性。
【具体实施方式】
[0028] 下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他 实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029] 本发明实施例
[0030] 一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，具体步骤如下：
[0031] (I)Fe3O4的合成：称取0. 33g聚乙二醇，加入8mL超纯水，超声直至聚乙二醇完全 溶解，称取2. 03g FeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取I. 5gFeCl 2加入到上述溶 液中至完全溶解，立即加入〇.5mL 0.1mol Γ1稀盐酸，通氮除氧15min，60°C水浴下边搅拌 边迅速加入60mL氨水，调转速至1500r mirT1，反应lh，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱5 次，真空冷冻干燥后保存备用；
[0032] (2)预聚合溶液的配制：将0· Ig Fe3O4加入ImL油酸中并用玻璃棒搅拌均勾，加入 101111^0.051]1〇117 1]\^氯仿溶液和110以1^功能单体，在4001'111；[]^1的转速下搅拌30111；[11，4°0 下静置2h形成A液；
[0033] (3)预乳化溶液的配制：将Span-80和tween-80各0· 5mL加入25mL超纯水中，再 加入700 μ L交联剂，在400r mirT1下搅拌30min形成B液；
[0034] (4)MG磁性分子印迹聚合物的制备：在400r mirT1转速搅拌下，将A液缓慢加入到 B液中，氮气除氧20min，将温度升到60°C，加入0.1 g偶氮二异丁腈引发聚合18h，反应结束 后用25mL甲醇破乳，抽滤后得到粗孔雀石绿磁性分子印迹聚合物，产物用体积比为9:1的 甲醇-乙酸混合液索氏提取至无孔雀石绿模板洗出，再用甲醇洗至中性，最后用超纯水洗 去甲醇，真空冷冻干燥后备用；
[0035] (5)半抗原的合成：将900mg 4-甲酰基苯甲酸、2. 4mL N, N-二甲基苯胺和2. 4g无 水