ZnCl2溶解在60mL无水乙醇中，氮气保护下加热回流24h，室温冷却后，加入30mL甲醇， 滴加氨水至沉淀产生，过滤后用水冲洗，真空中用KOH进行干燥得到羧基化的隐性孔雀石 绿；三氯甲烷溶解羧基化的隐性孔雀石绿，加入四氯对苯醌、冰醋酸25°C下搅拌反应I. 5h， 反应产物经等体积的三氯甲烷-四氯甲烷洗涤两次，真空干燥可获得半抗原羧基化孔雀石 绿粉末；
[0036] (6)酶标抗原的合成：将2mg半抗原羧基化孔雀石绿CMG粉末溶于ImL 20% 1^二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入211^11117屯00 33以1^，调？!14.5~5.0，反应201^11 后，迅速加入7. 5mg辣根过氧化物酶HRP，调pH至7. 0,室温反应3h得到CMG-HRP偶联物， 20 °C冷冻保存；
[0037] (7)检测：取20mg磁性分子印迹聚合物置于IOmL离心管中，加入浓度为0. 1~ 10000 μ gL·1的MG-PBS缓冲溶液3mL，然后立即加入稀释度为I :1500的酶标抗原溶液3mL， 不加 MG溶液的离心管为对照组，冰浴振荡吸附2h ;弃上层溶液，每管加入150 μ L底物显色 液邻苯二胺，显色30min后每管加入50 μ L终止液2mol Γ1的硫酸，立即在酶标仪上读数， 计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率，
[0038] 抑制率（B/BJ =样品吸光度（B)/阴性吸光度（Btl);
[0039] 绘制MG直接竞争ELISA标准曲线如图5所示。
[0040] 优选的，所述步骤（2)中的功能单体为α -甲基丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸。
[0041] 优选的所述步骤（3)中的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯苯或三羟甲基 丙烷三甲基丙烯酸酯。
[0042] 如图1所示，制备出的磁性分子印迹聚合物（左）和非印迹聚合物（右）的电镜 扫描图，聚合物的形貌规则，粒径均匀，在600nm左右。
[0043] 从图2可以看出，MIP和NIP的红外光谱图基本一致，这表明模板分子几乎完全 被洗脱。聚合物中主要的官能团可以通过相应的振动峰体现出来，其中2959CHT 1处是甲基 (-CH3)的伸缩振动峰，1737CHT1处为聚合物羰基（C = O)的伸缩振动峰，1641cm 4处是聚合 物中的双键（C = C)的伸缩振动峰，584CHT1处是Fe-O键的伸缩振动峰。
[0044] 由图3可知，磁性分子印迹聚合物具有很好的超顺磁性，饱和磁性强度为 54. lemu/g。由此可知制备出的MMIPs在外加磁场作用下可以迅速从样品中分离出来。
[0045] 由图4和图5可知，当温度低于265°C时，NIP处于一个相对稳定的状态，几乎没有 质量的损失；当温度升高到265°C后，NIP的质量开始大量地减少，当温度达到405°C时，NIP 的质量减少量达到80% ;MIP在温度低于268°C时很稳定，几乎没有质量的损失；当温度高 于268°C时，开始有质量损失，温度达到412°C时，质量减少量到达70%，说明磁性分子印迹 聚合物具有很好的热稳定性。
[0046] 由图6可知，CMG在629、429、320、251nm处具有特征吸收峰，HRP在403和268nm 处有特征吸收峰，而酶标抗原在628、291、226nm处具有特征吸收峰，同时CMG和HRP的一些 特征吸收峰消失，说明酶标抗原偶联成功。
[0047] 如图7所示，羧基化孔雀石绿中主要的官能团可以通过相应的振动峰体现出来， 其中3462CHT 1处是O-H的伸缩振动峰，1559CHT1和1449CHT1处为苯环上C = C的伸缩振动 峰，955cm \691cm 1处是苯环的伸缩振动。
[0048] 所建立ELISA方法的特异性验证：选择孔雀石绿及其结构类似物甲基紫、亮绿作 为分析物，建立dcELISA标准曲线，分别得到对应的IC50值，计算出交叉反应率（CR)，如表 1的结果表明，所制备的磁性分子印迹聚合物对孔雀石绿具有较高的选择性。
[0049] 表1 MG及其类似物的IC5tl值和交叉反应率
[0050]
【主权项】
1. 一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特征在于，具体步骤 如下： (1) Fe3O4的合成：称取0· 30~0· 36g聚乙二醇，加入7~9mL超纯水，超声直至聚乙 二醇完全溶解，称取2. 00~2. 06g FeCl3加入到聚乙二醇溶液中超声溶解，再称取1. 4~ 1.6g FeCl2W入到上述溶液中至完全溶解，立即加入0.4~0.6mL 0.1mol L4稀盐酸，通氮 除氧12~18min，60°C水浴下边搅拌边迅速加入55~65mL氨水，调转速至1500r mirf1，反 应lh，用磁铁进行吸附，并用超纯水洗脱4~6次，真空冷冻干燥后保存备用； (2) 预聚合溶液的配制：将0. 08~0. 12g Fe3O4加入0. 8~I. 2mL油酸中并用玻璃棒 搅拌均匀，加入8~12mL 0. 05mol IZ1MG氯仿溶液和43~170 μ L功能单体，在400r rnirT1的转速下搅拌25~35min，4°C下静置1. 5~2. 5h形成A液； (3) 预乳化溶液的配制：将Span-80和tween-80各0· 4~0· 6mL加入22~28mL超纯 水中，再加入475~950 μ L交联剂，在400r HiirT1下搅拌25~35min形成B液； (4) MG磁性分子印迹聚合物的制备：在400r HiirT1转速搅拌下，将A液缓慢加入到B液 中，氮气除氧18~22min，将温度升到60°C，加入0. 08~I. 2g偶氮二异丁腈引发聚合16~ 20h，反应结束后用22~28mL甲醇破乳，抽滤后得到粗孔雀石绿磁性分子印迹聚合物，产物 用体积比为8~10:1的甲醇-乙酸混合液索氏提取至无孔雀石绿模板洗出，再用甲醇洗至 中性，最后用超纯水洗去甲醇，真空冷冻干燥后备用； (5) 半抗原的合成：将850~950mg 4-甲酰基苯甲酸、2. 2~2. 6mL N，N-二甲基苯胺 和2. 2~2. 6g无水ZnCl2溶解在60mL无水乙醇中，氮气保护下加热回流22~26h，室温冷 却后，加入28~32mL甲醇，滴加氨水至沉淀产生，过滤后用水冲洗，真空中用KOH进行干燥 得到羧基化的隐性孔雀石绿；三氯甲烷溶解羧基化的隐性孔雀石绿，加入四氯对苯醌、冰醋 酸25°C下搅拌反应1~2h，反应产物经等体积的三氯甲烷-四氯甲烷洗涤2~3次，真空 干燥可获得半抗原羧基化孔雀石绿粉末； (6) 酶标抗原的合成：将1. 8~2. 2mg半抗原羧基化孔雀石绿CMG粉末溶于0. 8~ I. 2mL 20 % N，N-二甲基甲酰胺溶液，边磁力搅拌边加入1.8~2. 2mg mLlDC 32~24 μ L， 调pH 4. 5~5. 0,反应18~22min后，迅速加入7. 0~8. Omg辣根过氧化物酶HRP，调pH 至7. 8~7. 2,室温反应2. 5~3. 5h得到CMG-HRP偶联物，20 °C冷冻保存； (7) 检测：取18~22mg磁性分子印迹聚合物置于IOmL离心管中，加入浓度为0. 1~ 10000 μ gl/1的MG-PBS缓冲溶液2. 8~3. 2mL，然后立即加入稀释度为1 :1400~1600的酶 标抗原溶液2. 8~3. 2mL，不加 MG溶液的离心管为对照组，冰浴振荡吸附1. 5~2. 5h ;弃上 层溶液，每管加入140~160 μ L底物显色液，显色25~35min后每管加入45~55 μ L终 止液，立即在酶标仪上读数，计算各个浓度下MG对抗原抗体结合反应的抑制率。
2. 根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特 征在于，所述步骤（2)中的功能单体为α-甲基丙烯酸、丙烯酰胺或丙烯酸。
3. 根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特 征在于，所述步骤（3)中的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯苯或三羟甲基丙烷三 甲基丙烯酸酯。
4. 根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特 征在于，所述步骤（7)中的底物显色液为邻苯二胺。
5.根据权利要求1所述的水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，其特 征在于，所述步骤（7)中的终止液为2mol Γ1的硫酸。
【专利摘要】本发明公开了一种水产品孔雀石绿的磁性分子印迹仿生ELISA检测方法，它包括磁性分子印迹聚合物的制备和直接竞争ELISA方法的建立等实验步骤，本发明首先用乳液聚合法制备了粒径均匀的孔雀石绿磁性分子印迹聚合物（MG-MMIPs），并考察其吸附性能，将此MG-MMIPs作为仿生抗体，利用它对MG抗原和酶标记MG抗原的竞争性吸附，建立直接竞争的ELISA检测方法。该方法在最适反应条件下建立的标准曲线灵敏度为20.14μgL-1，最低检出限为0.12μgL-1，低于孔雀石绿快速检测卡的检出限2ppb(ng/g)；同时，该方法对MG具有很高的选择性，对MG的两种结构类似物（甲基紫和亮绿）的交叉反应率分别为7.4%和3.9%。
【IPC分类】G01N33-543, G01N33-02
【公开号】CN104833781
【申请号】CN201510274020
【发明人】黄志勇, 李璐, 林郑忠
【申请人】集美大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月26日