检测孔雀石绿的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及水产品检测的技术领域，尤其涉及一种检测孔雀石绿的胶体金免疫层 析试纸条及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 孔雀石绿作为染色剂，用于皮革业、纺织业、制陶业、食品和生物的染色，是人工合 成的三苯甲烷类化学物。同时，孔雀石绿也可以用作杀菌剂，驱虫剂，用于预防与治疗水生 动物细菌、真菌和寄生虫的感染，由于其成本低，效果显著，所以被普遍用在水产养殖业中。 然而随着研宄的深入，孔雀石绿的高毒性，高残留的性质及潜在的致畸、致癌、致突变等毒 副作用倍受大家的关注。
[0003] 继"苏丹红1号"后，2005年英国发现的鲑鱼体内的"孔雀石绿"事件又一次掀起 了大的食品安全风暴。同年六月，在对我国湖北、河南等地区的水产养殖业的调查中发现， 孔雀石绿被用来预防和治疗鱼的水霉病、小瓜虫病等和延长在运输过程中鱼鳞受损的鱼的 生命，该发现引起了国家的重视和民众的恐慌。孔雀石绿在2002年被作为禁用兽药列入 禁止在食品动物中使用的兽药名单上，因此我国要求孔雀石绿不得在食品中检出。近些年 来，水产品安全问题越来越受到重视，如我国制定了一系列法律法规，加强对水产品监督管 理，完善可追溯体系，普及水产品养殖技术等相应措施，但是违法添加禁用渔药的事件仍是 频频曝光。2005年香港在一批来自内地的一些豆豉鲮鱼罐头中查出含有孔雀石绿，大大降 低了这些罐头的销售额；2006年由于加工鳗鱼中查出孔雀石绿，导致第一天然食品利润下 跌。英国、美国、日本等一些国家已经将孔雀石绿列为食品中不得检出的药物，欧盟也对孔 雀石绿的残留量做出明确规定，检出限为2 μ g/kg。孔雀石绿的屡禁不止不仅使消费者人心 惶惶，还使我国经济遭受损失，在多个批次出口的水产品中查出药残超标，让我国水产品出 口受到限制和环境壁皇。严重影响我国水产养殖业经济名誉和健康发展。
[0004] 水产品的安全问题受到了政府和人民的广泛关注，尤其是孔雀石绿的屡禁不止， 让大家对水产品安全更为忧心忡忡。因此，我们不仅要增强对孔雀石绿的监督管理，还要加 强检测力度。目前检测药残的方法主要是应用仪器进行检定，但是这些方法操作复杂，所需 时间长，成本高，不适于大批量检测，所以要建立一种快速检测方法，能够快速，简单的实现 现场检测，保证食品来源是健康、安全的，从而有效的实现食品安全生产的各个环节。
[0005] 目前，常用于检测孔雀石绿残留量的方法主要包括：理化分析法、微生物学检测法 和免疫分析检测法。常见的理化分析检测法有高效液相色谱法、色谱-质谱联用技术、薄层 色谱法、毛细管电泳法等，这些检测方法灵敏度高，检测结果可靠，常作为确证方法检测药 物残留，但设备昂贵，样品前处理过程复杂，对操作人员要求高，耗时较长，不适合批量样品 的快速检测。微生物学检测法不需要专业昂贵的仪器，但操作耗时长，特异性、敏感性差，容 易受其他药物的干扰，在定量上尚不成熟，检测结果有时不能满足国家最高残留限量的要 求，不能满足现代检测的需要。随着免疫学和免疫技术的飞速发展，免疫分析法迅速发展起 来，成为检测药物残留的一种新型方法。免疫分析法主要是利用抗原、抗体的特异性结合来 检测药物、蛋白质、激素、微生物等各种物质，主要分为：放射性免疫法、酶联免疫吸附法、免 疫传感器法、胶体金免疫层析技术等。胶体金免疫层析技术是一种新型的免疫标记技术，是 在免疫层析的基础上建立起来的，以胶体金为示踪物与抗原、抗体特异性反应相结合的一 种检测技术。该检测方法结果判读简单，不需要专业的操作人员，检测时间短，携带方便，特 别适合大批量样品的药物残留的快速筛查。
[0006] 在现有技术中，利用胶体金免疫法检测孔雀石绿药物残留的研宄也有不少，赵春 城等研制出用于检测无色孔雀石绿的胶体金免疫层析试纸条，检出限在20 μ g/L;山珊等 将试纸条上T线和C线的吸光度通过胶体金读取仪进行读取，建立了用胶体金试纸条定量 检测孔雀石绿的方法。欧美等国于20世纪70、80年代，就已经开始关注在动物体内抗生 素的残留问题，制定了兽药的最高残留量（MRL)、休药期（WDT)及相关的法规和标准。欧盟 (EU)规定了，孔雀石绿最高残留限量（MRL)为2 yg/kg。因此，现有技术的检测孔雀石绿的 胶体金免疫检测试纸尚不能满足欧美等西方国家的标准，对于产品出口来说，对于我国的 水产企业带来了很大的困难。
[0007] 有鉴于此，本发明人研宄和设计了一种检测孔雀石绿的胶体金免疫层析试纸条及 其制备方法，本案由此产生。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种特异性强、操作简便，检测快速、准确并适合现场使用 的专门用于检测检测孔雀石绿的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法，以便对孔雀石绿药 物进行高灵敏度的检测，符合欧盟及WTO的最低检出限的规定。
[0009] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题的技术方案是：
[0010] 一种检测孔雀石绿的胶体金免疫层析试纸条，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素包 被膜、吸水垫及PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素包被膜及所述吸水垫 依次搭接在所述PVC底板上，所述结合垫包被设有孔雀石绿单克隆抗体-胶体金标记物；所 述硝酸纤维素包被膜上设有检测线和质控线，所述检测线包被有孔雀石绿抗原，所述质控 线包被有羊抗鼠 IgG。
[0011] 一种检测孔雀石绿的胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：
[0012] 步骤一、胶体金的制备：取1个250mL烧杯，加入IOOmL 0. 01 %氯金酸溶液，于恒 温磁力搅拌器上使用温度档400°C对其进行加热，转速为300r/min，加热至沸腾状态后，沸 腾时的实际温度为l〇〇°C，向烧杯中快速加入2mL 1 %柠檬酸三钠溶液，烧杯中的溶液变为 红色后再加热lOmin，直至溶液透亮，冷却至室温，4°C密封保存，即制得胶体金；
[0013] 步骤二、金标抗体的制备及纯化：取调好pH为9. 0的所述胶体金ImL于2. OmL离 心管中，向离心管中加入15 μ g/ml的孔雀石绿单克隆抗体，用涡旋仪涡旋IOmin后静置 15min ;向离心管中加入30 yL 10% BSA溶液，用涡旋仪涡旋lOmin，静置lOmin，制得金标 抗体，即孔雀石绿单克隆抗体-胶体金标记物；
[0014] 同时，将制得的金标抗体溶液于4°C 2500r/min，离心10min，去除下层沉淀，将上 清液转到另一离心管中，于4°C 9000r/min，离心30min，去除上清液，将沉淀用胶体金稀释 溶液稀释至原体积的1/20,于4°C保存备用；
[0015] 步骤三、试纸条的组装：（1)将硝酸纤维素包被膜，即NC膜，和吸水垫分别贴于PVC 底板上，吸水垫压住NC膜上方l-2mm ; (2)将粘贴好NC膜和吸水垫的PVC底板在切条机上 切割成4_宽的试纸条；(3)将样品垫和结合垫切成4_宽的条，同时将结合垫浸泡金标抗 体溶液中，并于37°C烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫剪成Icm长的小块并贴于PVC 底板上，金标垫压住NC膜下方l-2mm，同时用样品垫压住金标垫下方l-2mm，根据试纸条长 度修剪样品垫；（5)在结合垫和吸收垫之间的NC膜上依次包被孔雀石绿抗原和羊抗鼠 IgG， 分别作为检测线和控制线，采用BioDot划膜仪进行包被划线，具体参数为平台移动速度 4〇1111]1/8，单位喷量：检测线为0.8以17〇]1，质控线为1.0以17〇]1，使得孔雀