的确定
[0146] W最适McAb包被浓度包被酶标板，最适册N2CIV尿囊液稀释度加样。兔抗 册N2CIV多克隆抗体作 20、10、5、2.5、1.25、0.625yg/mL倍比稀释，Goatanti-Rabbit IgG(H&L)-HRP作 1 ;10000、1 ;20000、1 ;40000、1 ;80000 倍比稀释。W此程序进行方阵试验， 确定兔抗H3N2CIV多克隆抗体和酶标抗体最佳工作浓度。判断标准同实施例1。
[0147]S、双抗体夹屯、化ISA最佳反应条件的确定
[0148] 在确定各种抗体抗原最适反应浓度后，依次对封闭液种类（0. 1 %BSA，1 %BSA， 5%脱脂乳，1%PVA，0. 5%PVA)，各步反应作用时间0). 5、1、1. 5、化），底物显色时间巧、10、 15、20min)等条件逐一优化。判断标准同实施例1。
[0149] 经试验确定McAb最适包被浓度为0. 25yg/mL;最适册N2CIV尿囊液稀释度为 1:128;最适兔抗册N2CIV多克隆抗体工作浓度为2.Syg/rnL;最适Goatanti-Rabbit IgG(H&L)-HRP稀释度为1 ;10000 ;最佳封闭液为5%脱脂奶粉；最佳封闭时间、最佳尿囊液 解育时间、最佳多抗解育时间、最佳酶标抗体解育时间及最佳底物显色时间分别为1.化、 2h、1.化、比、lOmin，如表14至表19所示。
[0150] 表14最适McAb包被浓度和册N2CIV尿囊液最佳工作浓度化ISA试验结果
[0151]
[0154]
[0155] *各孔相对应空白对照组试验结果如表16
[0156] 表16兔抗册N2 CIV多克隆抗体和酶标抗体工作浓度空白对照组试验结果
[0157]
[0162]
[0165] 四、双抗体夹屯、化ISA检测方法阴阳性判定标准的确定
[0166] 用上述已建好的双抗夹屯、化ISA方法检测16份10日龄SPF鸡胚尿囊液。W最佳 稀释倍数H3N2CIV尿囊液作阳性对照。计算阴性样本0〇45。"平均值狂）及其标准差（SD)， 根据统计学原理，求得阴阳性界限狂+350)。目日，当0〇45。"值>狂+350)时，样品可在99.9% 的可信度上判断为阳性，当狂+3SD) 狂+2SD)时判为可疑，需再次检测或结合其 他更灵敏的方法检测；当《狂+2SD)时，则判为阴性。
[0167] 结果表明；在上述最优条件下，用16份SPF阴性鸡胚尿囊液进行化ISA检测，平 均孤45。》值X为0. 131，SD为0. 032,得到阳性临界值为狂巧SD) = 0. 228,阴性临界值为 狂+250)=0.195。即，当样品0〇45。">〇.228时，可^在99.9%的可信度上判断为阳性；当 样品0. 228 > 0〇45。"> 0. 195时判为可疑；当样品0D45。"《0. 195时，则判为阴性（图7)。 [016引实施例4双抗夹屯、ELISA试剂盒的建立
[0169] 按下列组成配制ELISA检测试剂盒：
[0170]含有 0. 25yg/mL McAb;2. 5yg/mL兔抗册N2CIV多克隆抗体；最适Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP稀释度为1 ;10000 ;封闭液为5%脱脂奶粉。
[0171] 实施例5实施例4所述试剂盒敏感性试验
[017引在最佳反应条件下，将册N2CIV尿囊液;户、1 ;2\1 ;22、1 ;23、1 ;2\1 ;25、1 ;26、 1 公、1 ;28、1 ;29、1 ;2W、1 ;2ii、l;2i2、l;2"、1 ; 2"、1 ;2"倍比稀释后，采用实施例 4 制得的 试剂盒的化ISA实验和HA试验同时测定其效价，确定病毒尿囊液最大稀释倍数，比较该两 种方法检测册N2CIV的敏感性。
[017引采用双抗夹屯、化ISA方法测定册N2CIV尿囊液不同稀释度的0045。心直，当0D值> 0. 228即判为阳性。册N2CIV尿囊液不同稀释度化ISA效价，如图8所示，该册N2CIV 尿囊液的化ISA效价为1 ; 128。经血凝试验测定，该册N2CIV尿囊液HAU为1 ;32。本实验 构建的双抗夹屯、化ISA方法的检测灵敏度是HA方法的8倍。
[0174]实施例6实施例4所述试剂盒特异性试验
[01巧]在最佳反应条件下，WCDV、CPV、CPIV、CAV-IKCRVw及H7N9、H10N8、H9N2、册N8 亚型流感病毒为待检样品。WH3N2CIV尿囊液为阳性对照，确定实施例4制得的试剂盒的 特异性。
[017引WCDV、CPV、CPIV、CAV-II、CRVW及H7N9、H10N8、H9N2、册N8亚型流感病毒为待 检样品进行双抗夹屯、化ISA检测。结果显示册N8亚型EIVODawJ直大于临界值，为0. 298， HAU相应为24。其它被检病原ODawJ直均小于临界值，其中，H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病 毒HAU相应分别为为26、26、26。表明本研究建立的ELISA方法对册N8亚型EIV有较弱的交 叉反应，而对犬常见呼吸道病毒及H7N9、H10N8、H9N2亚型流感病毒无交叉反应性（图9)。
[0177] 实施例7实施例4所述试剂盒重复性试验
[0178] 取3块不同批次包被的酶标板，用实施例4制得的试剂盒检测4份己知HAU的H3N2 CIV尿囊液样品。在同一块酶标板上进行批内重复，每份样品重复5孔。不同酶标板之间进 行批间重复。根据测定的ODawJ直，计算其变异系数（CV)，CV=SD/XX100%。如果变异 系数<10%，则说明其重复性和稳定性好。
[0179] 结果表明；4份鸡胚尿囊液ODawJ直批内变异系数在2. 40%~6. 56%之间，批间 变异系数在3. 82 %~7. 28 %之间，均小于10%，具有良好的重复性（表20)。
[0180] 表20双抗夹屯、ELISA重复性试验（n= 4)
[0181]
[0183] 实施例8利用实施例4所述试剂盒检测临床样本
[0184] 采用实施例4制备的试剂盒对346份本实验室所收集的犬鼻拭子进行检测，发 现阳性样品8份，检出率为2. 31%。而采用鸡胚分离病毒仅检出1份阳性样品，检出率为 0. 29%。两种方法阳性符合率为12. 5%，阴性符合率为100%，总符合率为98% (表21)。
[0185] 表21犬鼻拭子临床样品检测结果
[0186]
【主权项】
1. 一种检测H3N2亚型犬流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含杂交瘤细胞 株H3N2-CIV-HA-2C5产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中 国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC C201555。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括适于权利要求1所述单克隆抗 体和H3N2亚型犬流感病毒发生抗原抗体反应的检测试剂。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒，包括 包被有H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体的固相载体、鸡源或兔源的H3N2亚型犬流感 病毒的多克隆抗体、酶标抗体；所述H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗体由交瘤细胞株 H3N2-CIV-HA-2C5产生，所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏 中心，保藏编号为CCTCC C201555。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液、洗涤液、显 色液、终止液、阳性和阴性对照。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述兔源的H3N2亚型犬流感病毒的多 克隆抗体的制备过程如下：用纯化的H3N2亚型犬流感病毒免疫兔，背部皮下分多点注射， 分别在0, 2,4周共免疫三次，首次免疫为1.5 mg/只，二免和三免为2 mg/只，三免后分离 血清纯化得到。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标抗体为Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRPo7. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为H3N2 CIV尿囊液，阴 性对照为SPF阴性鸡胚尿囊液。8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述H3N2亚型犬流感病毒的单克隆抗 体的包被浓度为〇. 25 y g/mL ;兔源的H3N2亚型犬流感病毒的多克隆抗体浓度为2. 5 y g/ mL ;Goat anti-Rabbit IgG(H&L)-HRP 稀释度为 I : 10 000 ;封闭液浓度为 5%。9. 权利要求1至8任一项所述试剂盒在检测犬流感病毒中的应用。
【专利摘要】本发明涉及免疫学技术领域，具体公开了一种检测H3N2亚型犬流感病毒的试剂盒，所述试剂盒包含杂交瘤细胞株H3N2-CIV-HA-2C5产生的单克隆抗体，所述杂交瘤细胞株于2015年5月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： C201555；用该试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，重复性和稳定性都很好，检测临床样本，检出率为大大高于常规检测，具有实际的临床应用意义。CCTCC NO： C20155520150513
【IPC分类】G01N33/577, G01N33/569
【公开号】CN104965083
【申请号】CN201510279068
【发明人】李守军, 李陆涛, 袁子国, 孙凌霜, 贾坤, 远立国, 卢刚, 涂黎晴
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年5月27日