094] (4)加二抗：用10%胎牛血清-PBST将兔抗犬IgG-HRP作1:2000稀释，100uL/ 孔，37°C解育30min，甩干，洗漆3次。
[0095] (5)加底物；每孔加入新鲜配制的TMB底物溶液，100yL/孔，避光显色lOmin。 [009引（6)终止；加入终止液，50yL/孔，终止反应。
[0097] (7)测0〇45。值：在450nm处，用自动酶标仪测定各孔0D值。
[009引上述的犬弓形虫抗体间接化ISA检测原理图如图7所示。
[0099] 实施例4临界值的确定；
[0100] 用已建立的间接化ISA方法对15份弓形虫阴性的犬血清进行检测，计算出血清的 的平均值狂）为0. 326,标准偏差（SD)为0. 079,按照公式；阴阳性临界值=X+2SD 得出本试验的临界值为0. 484。当血清0. 484时，结果判定为阳性；当血清0D45。? < 0.484时，结果判定为阴性。
[0101] 实施例5敏感性试验
[010引用建立的间接化ISA检测方法检测37份犬弓形虫的阳性血清和15份犬弓形虫 的阳性血清，检出阳性血清36份，阴性血清15份，根据公式；敏感性=(检出份数/总份 数）X100 %，可W得出该方法的敏感性为98. 08 %。
[0103] 实施例6特异性试验
[0104] 用已建立的间接化ISA最佳条件分别检测犬细小、犬癌热、犬腺病毒病和犬副流 感病毒病的阳性血清，同时设立阳性对照、阴性对照和空白对照，每种重复4孔，用酶标仪 巧I]定OD4K1JI，结果表1所示：
[0105] 表1酶标仪0D值检测结果
[0106]
[0107] 结果显示，除犬弓形虫阳性血清〇〇45。值为阳性外，其余血清全为阴性。说明该重 组蛋白抗原与犬细小、犬癌热、犬腺病毒病和犬副流感病毒病的阳性血清均没有交叉反应， 建立的此间接化ISA方法具有良好的特异性。
[0108] 实施例7与其他化ISA试剂盒检测结果比较
[0109] 将37份犬弓形虫阳性血清样品分别用本研究组装的间接化ISA试剂盒、珠海海泰 生物科技有限公司购买的化ISA试剂盒W及兰州兽医研究所直接血凝试验试剂盒进行检 巧。，比较它们间的相关性和符合情况，结果如表2所示：
[0110] 表2不同ELISA试剂盒的检测结果
[0111]
[011引由结果可知，37份阳性血清，用本研究建立的间接化ISA检测方法检测结果有35 份呈阳性，阳性符合率为94. 59% ;珠海海泰生物科技有限公司购买的化ISA试剂盒检测有 36份呈阳性，阳性符合率为97. 3% ;兰州兽医研究所HIA试剂盒检测结果有35份呈阳性， 阳性符合率为94. 59%。可W看出本发明ELISA检测试剂盒的检测结果与其他公司的试剂 盒检测结果相差不大，甚至比一些公司的检测结果要好一些。
[0114]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的检测试剂盒中所用 的检测抗原为弓形虫R0P5重组蛋白。2. 根据权利要求1所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述的 弓形虫R0P5重组蛋白是通过以下方法制备而成： (1)提取RH株弓形虫的DNA ; ⑵根据GenBank中已发表的基因序列设计引物，PCR扩增出弓形虫R0P5基因，引物序 列如下： RH 株 R0P5F 如 SEQ ID NOl 所示； RH 株 R0P5R 如 SEQ ID N02 所示； (3) 扩增的PCR产物的回收与纯化； (4) PCR产物与PMD-18T克隆载体连接，连接产物转入DH5 a感受态细胞，经过BamHI 和Xho I酶切鉴定，筛选阳性克隆进行测序； (5) 经BamH I和Xho I双酶切的R0P5基因片段插入表达载体pET32a中构建重组表 达质粒 pET32a-R0P5 ; (6) 将重组表达质粒pET32a-R0P5转入BL21(DE3)感受态细胞中，培养后挑取阳性质 粒，酶切鉴定； (7) 将鉴定为阳性的克隆菌放入细菌到密度增殖培养基中培养，待菌液轻微混浊时， 将菌液接种于自动诱导表达培养基中诱导表达；用镍柱纯化重组蛋白，得重组融合蛋白 TgR0P5〇3. 根据权利要求2所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：步骤（2) 所述的PCR扩增条件为：94°C预变性4min，94°C变性lmin，61°C复性lmin，72°C延伸2min， 进行30个循环，最后72°C终延伸7min。4. 根据权利要求1所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：还包括： 1) 辣根过氧化物酶标记的兔抗犬IgG ; 2) 磷酸盐缓冲液为 15mM PBS :具体为 NaCl 8. Og，KH2PO4 0? 2g，Na2HPO4 ? 12H20 2. 9g， KCl 0. 2g，加蒸馏水定容至lOOOmL，调节溶液的pH值至7. 4 ; 3) 抗原包被液为50mM Tris盐酸缓冲液：具体为Tris 0. 60g，NaCl 0. 88g，加去离子水 90mL，完全溶解后用盐酸调节pH至7. 6,加去离子水定容至100mL ; 4) 洗涤液为15mM PBST :具体为含有0. 05% Tween-20的磷酸盐缓冲液； 5) 样品稀释液为1% BSA-PBST :具体为BSA Ig加入IOOmL PBST ; 6) 封闭液为5 %脱脂奶粉：具体为5g脱脂奶粉加入IOOmL PBS ; 7) 酶标二抗稀释液为10 %胎牛血清-PBST :具体为胎牛血清IOmL加入90mLPBST ; 8) 底物缓冲液为磷酸盐-柠檬酸缓冲液：具体为柠檬酸2. 553g Na2HPO4 ? 12H20 9. 2g 用去离子水定容至500mL，pH5. 0,4°C保存； 9. TMB贮存液：具体为TMB lg，DMSO 99mL，溶解后分装，4°C避光保存； 10. TMB底物显色液：具体为底物缓冲液99mL，TMB贮存液lmL，30% H2O2 100 y L，现配 现用； 11) 终止液：具体为浓硫酸21. 7mL，去离子水178. 3mL，将浓硫酸缓慢加入去离子水中， 边加边搅拌。5. 应用权利要求1~4任一项所述的试剂盒进行犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方 法，其特征在于：包括以下步骤：包被抗原、封闭、加样、加酶标二抗、显色、终止； 犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法的最佳的工作条件为：抗原浓度为1-25 yg/mL，样品稀释50倍，酶标二抗稀释浓度为1:2000,抗原包被时间I. 5h，抗原包被液是50mM Tris 盐酸缓冲液，封闭时间是lh，封闭液为5%脱脂奶粉，样品稀释液为1 % BSA-PBST，样品孵育 时间是2. 5h，酶标二抗稀释液为10%胎牛血清-PBST，酶标二抗孵育时间是30min，底物显 色时间lOmin，阴阳临界值为0. 484。6. 根据权利要求5所述的犬弓形虫抗体间接ELISA检测的方法，其特征在于：具体包 括以下步骤： a. 包被：用50mM Tris盐酸缓冲液将TgROP5重组蛋白稀释成1-25 y g/mL，包被ELISA 酶标板，100 U L/孔，37°C孵育I. 5h，甩干包被液，用洗涤液PBST洗涤3次，2min/次； b. 封闭：将每孔加300 y L封闭液5%脱脂奶粉，37°C孵育lh，甩干封闭液，用PBST洗 绦3次，2min/次； c. 加检测血清：将血清用1% BSA-PBST按1:50的比例稀释，设阴性和阳性对照，每孔 加入100 y L，37°C孵育2. 5h，甩干，洗涤3次； d. 加二抗：用10%胎牛血清-PBST将兔抗犬IgG-HRP作1:2000稀释，IOOy L/孔，37°C 孵育30min，甩干，同上洗涤3次； e. 加底物：每孔加入100 y L新鲜配制的TMB底物溶液，于37°C避光显色IOmin ; f. 终止：每孔50 y L加入终止液，终止反应； g. 结果判定：用酶标仪测450nm处的OD值；OD值彡0. 484为阳性，OD值< 0. 484为阴 性。
【专利摘要】本发明公开了一种犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒，属于生物检验检疫技术领域。本发明的犬弓形虫抗体间接ELISA检测试剂盒中所用的检测抗原为弓形虫ROP5重组蛋白。本发明通过基因克隆技术和原核表达，获取弓形虫重组蛋白ROP5，包括间接ELISA检测方法的建立，特异性试验、敏感性试验，以及与其他犬弓形虫检测试剂盒的比较。本发明的包被抗原可规模化标准化生产，检测方法特异性强、灵敏度高，可重复性强，结果判定客观，操作过程简单，可以进行大批量检测。适用于犬弓形虫病的流行病学调查、犬弓形虫感染的检测和临床诊断，为犬弓形虫病的诊断防治和流行病学调查提供一种快速、简便、特异的检测方法。
【IPC分类】G01N33/68
【公开号】CN104965086
【申请号】CN201510264492
【发明人】袁子国, 张秀香, 夏丽君, 李秀珍, 吕琳, 冯伟利, 吕淑媚, 文青元
【申请人】华南农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年5月21日