一种高效检测弓形虫急性感染的方法及其靶标蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，具体设及一种高效检测弓形虫急性感染的方法及 其祀标蛋白。
【背景技术】
[0002] 弓形虫是一种世界范围内寄生的原虫，可导致人畜流产、死胎和免疫抑制患者死 亡，其临床表现复杂，确诊困难，给公共卫生和畜牧业带来极大危害。在过去，免疫学检测方 法是弓形虫病的主要诊断方法，但是抗弓形虫IgG的检测难W区分急性感染和既往感染， IgM和IgA阳性也不能作为急性感染的标志。因此，弓形虫急性感染的早期诊断标志物有待 进一步寻找确定。
[000引弓形虫循环抗原（Circulating Antigens, CAg)是弓形虫急性感染期虫体自身排 泄和裂解产物，动物感染弓形虫1-2天即可检出CAg，2周后滴度显著降低，CAg阳性提示弓 形虫病急性、活动性感染，是病原体存在的重要标志，是早期感染的可靠指标。排泄-分泌 抗原巧xcretoir/SecretoiT Antigens，ESA)为CAg的主要成分，现有研究大多是提取ESA 抗原或者表达某个分泌蛋白制备多抗来检测血清中的CAg,由于CAg抗原的含量较少，且成 分复杂，从而使得该些方法的特异性、灵敏度有限。因此，目前尚缺少一种特异性和灵敏度 都较高的检测弓形虫的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服了目前检测弓形虫感染的方法难W区分急性 感染和既往感染、利用循环抗原来检测急性感染的方法因循环抗原含量低、成分复杂等原 因特异性和灵敏度有限的问题，提供了一种适用于弓形虫早期急性感染检测的高特异性、 高敏感性的检测方法，用所述检测方法能够快速检测弓形虫急性感染，并具有较高的特异 性和灵敏度。
[0005] 本发明技术方案之一：一种非疾病诊断治疗目的的检测弓形虫急性感染的方法， 其包括下述步骤：使待检测样本与弓形虫Coronin蛋白或所述弓形虫Coronin蛋白的抗体 发生反应。
[0006] 本发明中，所述待检测样本可W为本领域常规所指被弓形虫感染的样本，较佳地 为被弓形虫感染后的血清样本。
[0007] 本发明中，所述弓形虫Coronin蛋白可W为本领域常规所指，较佳地为氨基酸序 列如GenBank收录号为EPT25607. 1的序列所示，所述弓形虫Coronin蛋白的制备方法可W 为本领域常规的方法，如合成法或表达纯化法，较佳地为原核表达纯化法。所述原核表达纯 化方法较佳地包括下述步骤；培养含有所述弓形虫Coronin基因的原核表达载体的原核表 达菌株，破碎细胞，从裂解液中提取所述弓形虫Coronin蛋白。所述原核表达的菌株可W 为本领域常规的表达菌株，较佳地为大肠杆菌表达菌株，更佳地为大肠杆菌化21菌株。所 述原核表达的载体可W为本领域常规的表达载体，较佳地为祀T系列表达载体，最佳地为 祀T28a载体。所述提取方法可W为本领域常规，较佳地为层析法，更佳地为亲和层析法，最 佳地为镶离子-6组氨酸亲和层析法。
[000引本发明中，所述弓形虫Coronin蛋白的抗体可W为本领域常规所指的抗体，如单 克隆抗体或多克隆抗体。所述弓形虫Coronin蛋白的抗体的制备方法可W为本领域常规的 制备方法，较佳地包括下述步骤；将所述弓形虫Coronin蛋白免疫动物后制得所述抗体，更 佳地包括；将所述弓形虫Coronin蛋白免疫动物，二次免疫后采集血液分离含有所述抗体 的血清。所述动物可W为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔或小鼠，更佳地为小鼠。所 述免疫注射可W为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫Coronin蛋白注射到动物 体内，较佳地为将所述弓形虫Coronin蛋白与弗氏佐剂一起注射到所述动物体内。所述二 次免疫的间隔时间较佳地为2周，所述采集血液较佳地为从所述动物的尾静脉采集。
[0009] 本发明中，所述反应可W为本领域常规所指，较佳地包括下述步骤；（1)将所述弓 形虫Coronin蛋白或所述弓形虫Coronin蛋白的抗体包被于基质上；（2)向步骤（1)中包被 有所述弓形虫Coronin蛋白或所述弓形虫Coronin蛋白的抗体的基质上加入待检测样本， 使其与所述弓形虫Coronin蛋白或所述弓形虫Coronin蛋白的抗体发生反应。
[0010] 本发明中，较佳地还可W包括步骤（3);检测步骤（2)所述反应的结果。所述检测 可W为本领域常规的检测方法，较佳地为检测抗原与抗体反应的检测方法，例如当基质上 包被的为Coronin蛋白时，在步骤（2)后加入辣根过氧化物酶（HR巧标记的抗IgG的抗体 后解育、显色并测定化学发光值；当基质上包被的是所述检测弓形虫急性感染的抗体时，在 步骤（2)后加入与所述检测弓形虫急性感染的抗体异源的Coronin抗体，解育后再加入辣 根过氧化物酶（HR巧标记的抗IgG的抗体后再解育、显色并测定化学发光值。
[0011] 本发明技术方案之二：一种检测弓形虫急性感染的抗体，其是通过包括如下步骤 的制备方法所制得的：将弓形虫Coronin蛋白免疫动物后制得所述抗体。
[0012] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的抗体可W为本领域常规所指的抗体，如单 克隆抗体或多克隆抗体。所述检测弓形虫急性感染的抗体的制备方法可W为本领域常规的 制备方法，较佳地包括下述步骤；将前述弓形虫Coronin蛋白免疫注射动物，二次免疫后采 集血液分离含有所述抗体的血清。所述动物可W为本领域常规使用到的动物，较佳地为兔 或小鼠，更佳地为小鼠。所述免疫注射可W为本领域常规的注射方式，如直接将所述弓形虫 Coronin蛋白注射到动物体内，较佳地为将所述Coronin蛋白与弗氏佐剂一起注射到动物 体内。所述二次免疫的间隔时间较佳地为2周，所述采集血液较佳地为从动物的尾静脉采 集血液。
[0013] 本发明技术方案之一种检测弓形虫急性感染的试剂盒，其包括前述Coronin 蛋白和/或前述检测弓形虫急性感染的抗体。
[0014] 本发明中，所述检测弓形虫急性感染的试剂盒较佳地还可W包括免疫反应封闭 液、免疫反应洗漆液、免疫反应终止液和偶联有显色反应酶的抗IgG的抗体。
[0015] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0016] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0017] 本发明的积极进步效果在于；本发明所提供的一种检测弓形虫急性感染的祀标 蛋白及其抗体，W及一种利用所述祀标蛋白及其抗体的检测弓形虫急性感染的方法能够有 效、快速地检测弓形虫早期急性感染，，并具有较高的特异性和灵敏度。
【附图说明】
[001引图1、不同物种Coronin氨基酸序列的进化树分析表明。
[0019] 图2、弓形虫Coronin基因的RT-PCR结果。
[0020] 图3、弓形虫Coronin蛋白His?Bind柱纯化结果。1 ;流穿液，2 ;漂洗液，3 ;洗脱 液。
[0021] 图4、弓形虫Coronin蛋白的组织定位。
【具体实施方式】
[0022] 下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的"室温"是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。
[0023] 下述实施例中的实验材料、仪器和试剂的来源如下：
[0024] 实验动物与微生物；昆明小鼠和BALB/c购自上海斯莱克实验动物有限公司；比格 犬购自上海新冈试验动物场；弓形虫RH株购自国家兽医微生物菌种保藏管理中屯、；大肠杆 菌化21 〇)E3)和大肠杆菌TOP10感受态细胞购自北京康为世纪生物科技有限公司。
[0025] 实验细胞与试剂；Vero细胞购自中科院上海生化与细胞研究所；DMEM、膜酶购 自Gibco公司；BSA、弗氏佐剂购自Sigma公司；复合型蛋白酶抑制剂购自Merck公司； NormalMouseIgG、ProteinA琼脂糖微球、DAPI购自碧云天生物技术有限公司；Alexa Fluor488标记的驴抗鼠IgG购自Jackson公司出isBandResin试剂盒购自默克公 司；BCA蛋白定量试剂盒和二硫苏糖醇值TT)购自Bio-Rad公司；总RNA反转录试剂盒 购自ThermoScientific公司；pMD19T质粒购自宝生物工程（大连）有限公司；pET28a 质粒购自Novagen公司；氨节青霉素购自和卡那霉素购自生工生物工程股份有限公司； 3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺、多聚甲醒、Triton-X100购自国药集团化学试剂有限公司；弓I 物由苏州金唯智生物技术有限公司合成；DNA测序由宝生物工程（大连）有限公司进行。
[0026] 实验仪器；色谱柱RP-C18购自ColumnTechnologyInc.;色谱仪 Zorbax300SB-C18peptidetraps购自AgilentTechnologies,Wilmington,DE；QExactive 质谱仪购自ThermoFisherScientific;激光共聚焦显微镜NikoneclipseCl-Si购自巧 康（Wkon)公司。
[0027] 实施例1获得弓形虫ESA抗原并制备多抗
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