一种胃蛋白酶原Ⅰ酶促化学发光检测试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属免疫检测分析技术领域，尤其设及一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测 试剂盒。
【背景技术】
[0002] 该测试用于诊断严重萎缩性胃体胃炎，W及提示早期胃癌风险。血清或血浆PGI(P-PGI，S-PGI)检测法是检测严重萎缩性胃体胃炎的一种可靠方法，其敏感性和特异性 分别为92 %和90%。
[0003]胃蛋白酶原（Pesinogen，PG)是胃液中胃蛋白酶的无活性前体，由胃体的主细胞 和黏液细胞分泌。大部分分泌到胃腔，少量可在血液中被检测到。PGI水平与胃体黏膜主细 胞的数量具有可靠相关性。血清PG水平反映了不同部位胃黏膜的形态和功能；PGI是检 测胃泌酸腺细胞功能的指标，胃酸分泌增多PGI升高，分泌减少或胃黏膜腺体萎缩PGI 降低；PGII与胃底黏膜病变的相关性较大（相对于胃窦黏膜），其升高与与胃底腺管萎缩， 胃上皮化生或假幽口腺化生、异型增值有关；PGI/II比值进行性降低与胃黏膜萎缩进展 相关。因此，联合测定PGI和PGII比值可起到胃底腺黏膜"血清活检巧r的作用。
[0004] 化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术后发展起来 的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射同 位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。化学发光的原理是在化学反应中生成 的不稳定的激发态中间体，当其回到基态时，释放光子。在免疫检测分析中，使用化学发光 技术，可W使检测范围达到6个数量级，而且灵敏度很高，加上标记物稳定，有效期长，使其 受到越来越多的关注与应用。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种W磁性微粒为固相分离 载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传 统化ISA方法，抗原，抗体的结合反应是在固相巧LISA板反应孔）表面进行的，而磁分离酶 联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速，彻底。 与传统化ISA相比具有自动化程度高、灵敏度高、检测用时少的优点。但目前市场上检测PG I试剂盒主要W传统化ISA法为主。
【发明内容】
[0005] 本发明需要解决的技术问题在于提供一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂 盒，使对人胃蛋白酶原I检测实现了自动化、高特异性和灵敏度。
[0006] -种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括酶标液、 胃蛋白酶原I标准品、包被胃蛋白酶原I单克隆抗体的免疫磁珠、样本稀释液、化学发光底 物液、洗漆液。
[0007] 所述的一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，将胃蛋白酶原 I单克隆抗体包被在磁珠微球表面，经捕捉样本中的胃蛋白酶原IW及加入酶标胃蛋白酶 原I单克隆抗体试剂后，形成固相-抗体-抗原-酶标抗体夹屯、免疫复合物。
[0008] 所述的一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述的包被胃 蛋白酶原I单克隆抗体的免疫磁珠为含有标记有抗胃蛋白酶原I单克隆抗体的磁性微 球；
[0009] 所述的酶标液中酶标抗体的酶是辣根过氧化物酶；
[0010] 所述的洗漆液是含有吐温-20的缓冲液；
[0011] 所述的化学发光底物溶液是酶促化学发光底物溶液。
[0012] 任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述包被胃蛋白酶原I单克隆抗体的免疫磁 珠按如下方法制得：
[0013] (1)初洗缓冲液的配制：
[0014] 称取0. 1952g的MEShygrate于100ml的纯水中，调整抑至5. 0;
[00巧]加入50y1吐温-20,配成0.Olmol/LMES缓冲液，调整抑至5. 0;
[0016] (2)偶联缓冲液的配制：
[0017] 称取0. 38138g化284〇7? 10&0溶于40ml纯水中，得到0. 05mol/L的棚砂溶液； [001引称取0. 1237g邮03溶于10ml纯水中，得到0. 2mol/L的棚酸溶液；
[001 引 取 18ml0. 05mol/L的NasBA溶液与 2ml0. 2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至 80ml得0. 05mol/L棚酸缓冲液；
[0020] (3)终洗液的配制：
[0021] 称取2. 78g化2册〇4溶于100ml纯水得0. 2mol/L化2册〇4溶液；
[0022] 称取 1. 2g化&?〇4溶于 50ml纯水得 0. 2mol/LNaH2PO4溶液；
[0023]取 81ml0.2mol/LNa2HP〇4溶液与igml0.2mol/LN址2PO4溶液混合，得 0. 2mol/L PB缓冲溶液得0. 2mol/Lro缓冲溶液；
[0024]取 50ml0. 2mol/LPB缓冲液，2 倍稀释到 100ml，加入 0. 9gNaCl, 0. 5g0. 5% -1% 的BSA，0. 02-0. 03%生物防腐剂、0. 05%吐温20,充分溶解混匀；
[00幼 （4)封闭液的配制：
[002引取100mlTris缓冲液，将溶液的抑调节成8. 5-9. 0之间；
[0027]向其中加入2%BSA;
[002引 巧化DC溶液和N服溶液的配制；
[0029] 称取25mg/ml的1-(3-二甲氨基丙基）-3-己基碳二亚胺，溶解于1ml的初洗缓冲 液中，配制成25mg/ml的邸C溶液；
[0030] 称取25mg/ml的N-哲基班巧酷亚胺溶解于初洗缓冲液中，配置成25mg/mlN服溶 液；
[0031] (6)磁珠包被过程：
[0032]A、初洗；取100y1磁珠，将其稀释成lOmg/ml的磁珠浓度，从中吸取100y1;磁分 离架上分离，去上清；用初洗液250y1洗漆=次，磁分离，去上清；
[003引 B、活化；取初洗完成的磁珠加入150y1MES，再加入50y1EDC及50y1的N服溶 液，充分混匀。室温下25°C活化30min，活化完成磁分离去上清，W250y1偶联缓冲液重悬 洗漆=次，分离去上清；
[0034]C、稀释抗G-17单克隆抗体：
[00巧]将抗G-17单克隆抗体从-20°c冰箱中取出，待其融化后取出20y1，用偶联缓冲液 1:20稀释到400y1，稀释后的抗体浓度为0. 0397mg/ml。
[003引 D、偶联；
[0037] 加入400y1用偶联缓冲液稀释的抗G-17单克隆抗体重悬活化后的磁珠，充分混 匀，其磁珠包被比率为Img磁珠；0. 0159mg抗体；
[0038] 37°C偶联化，37°C摇床摇晃恒温混匀；
[0039] E、封闭；
[0040] 将偶联结束的磁珠于磁分离架上分离，去上清；
[0041] 加入400y1封闭液，37°C摇床封闭比；
[0042] 封闭结束后去除上清；
[0043] F、终洗保存；
[0044] W400y1终洗液洗漆封闭完成的磁珠，重复立次，最终定容到500y1。
[0045] 本发明的工作原理为双抗体夹屯、法化学发光与免疫磁珠技术相结合的一种检测 方法。在标本中加入定量的包被胃蛋白酶原I单克隆抗体的免疫磁珠和HRP标记抗PGI 单克隆抗体。37°C解育后，包被胃蛋白酶原I单克隆抗体的免疫磁珠与HRP标记抗PGI单 克隆抗体分别与标本中PGI分子的不同表位结合，形成磁珠-抗体-抗原-抗体复合物。 在外加磁场中直接沉淀，即可分离。弃去上清液，清洗沉淀的复合物，然后加入酶促化学发 光底物。底物在酶的作用下催化裂解，形成不稳定的激发态中间体，当激发态中间体回到基 态时便发出了光子，形成发光反应，即可使用发光仪检测反应的发光强度，根据标准曲线即 可算出样品中的PGI含量。在检测范围中，发光强度与样本中的PGI浓度成正比。
[0046] 本发明的特征在于；检测血清中胃蛋白酶原I的方法使用了W下的试剂：
[0047] 本发明使用酶标液为HRP标记抗PGI单克隆抗体
[0048] 本发明的胃蛋白酶原I标准品是含有一定量的PGI抗原的BSA蛋白溶液。
[0049] 本发明所含的样本稀释液是含有1 %BSA的PBS溶液。
[0050] 本发明的化学发光底物液为酶促化学发光底物溶液。
[0051] 本发明的洗漆液是含有吐温-20和ProCline-300的缓冲液。
[0052] 本发明所述的胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒操作方法如下：
[0053] -、磁珠包被缓冲液配制：
[0054] 1.初洗缓冲液的配制：
[0(巧5] 1. 1称取0. 1952g的MEShygrate于100ml的纯水中，调整抑至5. 0。
[0056] 1. 2加入50y1吐温-20,配成0.Olmol/LMES缓冲液，调整抑至5. 0。
[0057] 2.偶联缓冲液的配制：
[0058] 2. 1称取0. 38138g化284〇7? 10&0溶于40ml纯水中，得到0. 05mol/L的棚砂溶液。
[0059] 2. 2称取0. 1237g邮〇3溶于10ml纯水中，得到0. 2mol/L的棚酸溶液。
[0060] 2. 3取ISml0.OSmol/L的NasBA溶液与加！ 0.2mol/L的H3BO3溶液混合，定容至 80ml得0. 05mol/L棚酸缓冲液。
[006。 3.终洗液的配制；
[0062] 3. 1称取2. 78g化2册〇4溶于100ml纯水得0. 2mol/L化2册〇4溶液。
[0063] 3. 2 称取 1. 2g化&?〇4溶于 50ml纯水得 0. 2mol/LNaH2PO4溶液。
[0064] 3. 3 取 81ml0.2mol/LNa2H