6。
[015引第S步；胃蛋白酶原I标准品的配制
[0159] 配制3瓶PGI标准品，含有0.l%ProCline300为防腐剂。每批试剂盒中PGI 标准液的浓度为 25yg/L、100yg/L、200yg/L。
[0160] 第四步；酶标液的配制
[016。 配制15血HRP标记抗PGI单克隆抗体，保存在0. 02%meth}dosothiazolone， 0. 02%bromonitrodioxne稳定剂及 0. 002%activeisothiazolone化防腐剂中。
[0162] 第五步；洗漆液的配制
[016引配制20ml(20倍稀释后使用）的浓缩磯酸盐缓冲液，含有吐温-20和0. 1 %ProCline-300 为防腐剂。
[0164] 第六步；底物液的配置
[0165] 1.配制底物缓冲液
[0166] 1. 1称取4. 542gTris,称取0. 458g棚酸钢，定容到300ml,调节抑至8. 7-9. 0。
[0167] 2.配制底物A液
[0168] 2. 1 称取 0. 023g过氧化氨脈，称取 0. 024g4-Mo巧holinopyridine(稳定剂）。
[0169] 2. 2用Tris-HCl加棚酸钢缓冲液定容到100ml，室温保存。
[0170] 3.配制底物B液
[0171] 3. 1 称取 0. 088g鲁米诺，称取 0. 051g3-(l〇-phenothiazinyl)propane-l-sulfo 打过te〇
[0172] 3. 2用Tris-肥1加棚酸钢缓冲液定容到100ml。
[0173] 3. 3用锡巧纸将配好的B液包裹起来，室温保存。
[0174] 第走步：本实施例用全自动化学发光检测仪器检测方式，步骤如下：
[01巧]1.仪器洗漆
[0176] 对仪器的测量室和清洗站进行10-15次洗漆，待其背景值下降，W及底物发光值 测量达到平稳，方可开始测量。
[0177] 2.加样与免疫反应
[017引 2. 1将足够量的磁珠，酶标抗PGI抗体依次加入全自动化学发光检测仪的试剂 盒中。
[0179] 2. 2在4ml试管中加入50-100y1血清或血浆样本标准品，依次放入全自动化学发 光仪器的样本盘中。
[0180]2. 3 -次反应吸取30y1PGI抗体磁珠试剂，酶标抗体一次加100y1，抗原标准 液加80yl。混匀后37°C温育30min。
[0181] 3.启动仪器，检测全程包括；加样，解育，洗漆，测量。
[0182] 4.洗漆反应杯；机械臂将解育槽中的的反应杯夹到动化学发光仪器的清洗站，清 洗站槽下为磁力吸附，仪器一支吸头是将上清吸取，一支管头是喷出洗漆液，清洗盘转一圈 共洗漆6次。
[0183] 7.加样结束后，在37°C温育槽解育30min后，反应杯被机械臂夹到清洗站，洗漆反 应杯；清洗站槽下为磁力吸附，仪器一支吸头是将上清吸取，一支管头是喷出洗漆液，清洗 盘转一圈共洗漆6次。
[0184] 8.加发光底物工作液；两个针管先后向反应杯中加入100 底物液，解育100s 后准备测量。
[0185] 9.读取发光值；将反应杯从清洗站转移到测量室中，测量，得到数值。
[0186] 第八步；临床样本检测
[0187] 图1为Img磁珠包被0. 0308m评GI单克隆抗体后对于不同浓度的PGI抗原得 到的化学发光值的趋势线。
[0188] 1.检测方案
[0189] 本试剂检测样本为人血清或血浆。
[0190] 采血前10小时应保持空腹。采集静脉血样至无添加剂的血清塑料试管或有邸TA 或肝素抗凝管内，及时上下颠倒试管5~6次W混匀样本。测试样本为血清时，需在室温 (20~25°C)放置至凝结（至少30分钟）。血清凝结后和血浆立即用离屯、方法（如用塑料 试管，加速至2000G，离屯、10~15分钟）分离。血浆/血清样本可冷藏于冰箱（2~8°C)， 如需更长时间的储存应冷冻（适宜在一70~一20°C储存）。样本在解冻后应混匀。避免 反复冻融。避免使用含有溶血素、油脂或污浊不纯的样本。
[0191] 标本采自1000例正常体检、供血者。血清样本体检结果均无肝、脑、肾、消化道疾 病，半年内无输液和大手术史，妇女不在妊娠期和哺乳期。将测值进行统计学分析，得出正 常血清参考范围；PGI在70-165yg/L范围。
[0192] 2.本发明试剂盒性能指标
[0193] 灵敏度：最低检出值0.lyg/L;精密性：批内变异CV% <10.0%、批间变异CV% <15. 0%;线性系数；r〉0. 9900;线性范围；1. 00 ~200yg/L。
【主权项】
1. 一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括酶标液、胃 蛋白酶原I标准品、包被胃蛋白酶原I单克隆抗体的免疫磁珠、样本稀释液、化学发光底物 液、洗涤液。2. 按照权利要求1所述的一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于， 将胃蛋白酶原I单克隆抗体包被在磁珠微球表面，经捕捉样本中的胃蛋白酶原I以及加入 酶标胃蛋白酶原I单克隆抗体试剂后，形成固相-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物。3. 按照权利要求1所述的一种胃蛋白酶原I酶促化学发光检测试剂盒，其特征在于， 所述的包被胃蛋白酶原I单克隆抗体的免疫磁珠为含有标记有抗胃蛋白酶原I单克隆抗 体的磁性微球； 所述的酶标液中酶标抗体的酶是辣根过氧化物酶； 所述的洗涤液是含有吐温-20的缓冲液； 所述的化学发光底物溶液是酶促化学发光底物溶液。4. 如权利要求1-3任其一所述的试剂盒，其特征在于，所述包被胃蛋白酶原I单克隆 抗体的免疫磁珠按如下方法制得： (1) 初洗缓冲液的配制： 称取0? 1952g的MES hygrate于100mL的纯水中，调整pH至5. 0 ; 加入50耵吐温-20,配成0? Olmol/L MES缓冲液，调整pH至5. 0 ; (2) 偶联缓冲液的配制： 称取0? 38138g Na2B4O7 ? IOH2O溶于40ml纯水中，得到0? 05mol/L的硼砂溶液； 称取0. 1237g H3BO3溶于IOml纯水中，得到0. 2mol/L的硼酸溶液； 取18ml 0. 05mol/L的Na2B4O7溶液与2ml 0. 2mol/L的H忑03溶液混合，定容至80ml得 0.05mol/L硼酸缓冲液； (3) 终洗液的配制： 称取 2. 78g Na2HPO4溶于 100mL 纯水得 0. 2mol/L Na2HPO4溶液； 称取I. 2g似&?04溶于50ml纯水得0. 2mol/L NaH2PO4溶液； 取 81ml 0.2mol/LNa2HP04溶液与 19ml 0.2mol/L NaH2PO4溶液混合，得 0.2mol/L PB 缓 冲溶液得〇. 2mol/LPB缓冲溶液； 取 50ml 0.2mol/L PB 缓冲液，2 倍稀释到 100ml，加入 0.9gNaCl, 0.5g0.5%-l% 的 BSA， 0. 02-0. 03%生物防腐剂、0. 05%吐温20,充分溶解混匀； (4) 封闭液的配制： 取100ml Tris缓冲液，将溶液的pH调节成8. 5-9. 0之间； 向其中加入2%BSA ; (5) EDC溶液和NHS溶液的配制： 称取25mg/ml的1- (3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺，溶解于Iml的初洗缓冲液 中，配制成25mg/ml的EDC溶液； 称取25mg/ml的N-羟基琥珀酰亚胺溶解于初洗缓冲液中，配置成25mg/ml NHS溶液； (6) 磁珠包被过程： A、初洗：取100W磁珠，将其稀释成lOmg/ml的磁珠浓度，从中吸取100W ;磁分离架上 分离，去上清；用初洗液250W洗涤三次，磁分离，去上清； B、 活化：取初洗完成的磁珠加入150WMES，再加入50W EDC及50W的NHS溶液，充分 混匀；室温下25°C活化30min，活化完成磁分离去上清，以250W偶联缓冲液重悬洗涤三次， 分离去上清； C、 稀释抗G-17单克隆抗体： 将抗G-17单克隆抗体从-20°C冰箱中取出，待其融化后取出20沿，用偶联缓冲液1:20 稀释到400M1，稀释后的抗体浓度为0. 0397mg/ml ; D、 偶联： 加入400沿用偶联缓冲液稀释的抗G-17单克隆抗体重悬活化后的磁珠，充分混匀，其 磁珠包被比率为Img磁珠：0? 0159mg抗体； 37°C偶联2h，37°C摇床摇晃恒温混匀； E、 封闭： 将偶联结束的磁珠于磁分离架上分离，去上清； 加入400W封闭液，37°C摇床封闭Ih ; 封闭结束后去除上清； F、 终洗保存： 以400W终洗液洗涤封闭完成的磁珠，重复三次，最终定容到500耵。
【专利摘要】本发明公开了一种胃蛋白酶原Ⅰ酶促化学发光检测试剂盒。属于免疫检测分析技术领域。该试剂盒由酶标液、胃蛋白酶原Ⅰ标准品、包被抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体的免疫磁珠、样本稀释液、化学发光底物液、洗涤液组成。其原理将胃蛋白酶原Ⅰ抗体连接在磁珠微球表面作为固相试剂，经捕捉样本中的胃蛋白酶原Ⅰ以及加入酶标抗胃蛋白酶原Ⅰ单克隆抗体试剂后，形成固相-抗体-抗原-酶标抗体夹心免疫复合物。本发明的优点在于：将化学发光技术与免疫磁珠技术相结合，制备的试剂盒具有灵敏度高、特异性好、线性范围广及稳定性好，能满足临床对胃功能检测的需求。
【IPC分类】G01N33/543, G01N21/76, G01N33/573
【公开号】CN104965077
【申请号】CN201510268536
【发明人】王明丽, 洪叶, 赵俊, 刘峰
【申请人】必欧瀚生物技术（合肥）有限公司, 刘峰
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年5月22日