可规模化生物元素分析的制作方法
【专利说明】可规模化生物元素分析
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求与2012年7月3日提交的美国临时专利申请序列第61/667, 930号的 权益，该临时申请以其整体通过参考引入本文。 【背景技术】 技术领域
[0003]
[0004] 本发明涉及对样品或系列样品中的一个或多个分析物进行检测。更具体而言，本 发明涉及用于测定生物元素种群中的一种或多种生物元素（例如生物细胞）的方法。
[0005] 相关技术
[0006] 利用常规技术，可对生物学文库筛选含有例如细胞、抗体、蛋白质、肽和核酸的组 分。这些技术包括噬菌体展示、核糖体展示、酵母细菌展示、体外区分、微雕法和空间寻址 (spatial addressing)。这类体系具有很多缺点，包括需要经由选择步骤（包括例如"淘 洗"）来富集所需克隆，该步骤固有地导致潜在结合候选物的损失。此外，难以利用常规技 术建立正信号的精确起源，这是因为常规技术从异源种群获取混合信号，而不能被去卷积。 通常，这些技术涉及利用噬菌体、核糖体和特定细胞的选择过程，大部分过程在体外进行。
[0007] 文库筛选上的改进已经引入了空间寻址的概念，以便在选择过程中保持所筛选组 分的身份。这类寻址可基于包括机器人学、酶联免疫吸附测定或基于细胞的测定在内的技 术。尽管空间寻址例如能够鉴定特定细胞克隆以产生原种，但是这些方法不利于高通量筛 选技术来选择性分离并纯化已鉴定克隆以便迅速用于疾病诊断和治疗。目前筛选方法另一 缺点在于其通常局限于约5-10万之间的细胞数。
[0008] 对于进行基于细胞的筛选，最特别的挑战之一在于以允许实施随后的筛选步骤的 方式来分离小的细胞种群。传统的分离细胞的装置和方法不适于在不执行可潜在改变细胞 功能或活性的步骤的情况下提供小的细胞种群的分离。细胞分离不仅在筛选方面是重要 的，而且在涉及监控、测量和/或利用细胞活性或功能（例如抗体制备）输出的过程中也是 重要的。
[0009] 因此，对从背景种群中分离少量特定细胞的需求是普遍的，其应用于病理学、临床 诊断、克隆和细胞生物学研宄。目前的筛选方法具有很多技术挑战，包括：所展示的蛋白质 的尺寸必须要小，复合感染要高以便避免多样性损失，对噬菌体活性的依赖性、多重淘洗过 程是必需的（需要1周或更多），由于噬菌体、抗体，高度非特异性结合以可溶形式可能不能 很好行使功能（通常表达截短的克隆），和/或亲和力效应可能阻碍对高亲和力克隆的选 择。
[0010] 因此，本发明人已经认识到在本领域中对鉴定、分离及表征生物种群组分的更有 效的方法存在需求。
【发明内容】
[0011] 在一个方面，本发明涉及用于检测样品中的分析物的方法。所述方法部分基于样 品中的微粒部分或完全抑制电磁辐射经过含样品的容器中的检测表面而传播到样品中及 从中传播出来的能力。在一个实施方式中，该方法包括向含样品溶液的反应容器中添加第 一颗粒和发射电磁辐射的第一标记，其中该第一标记结合于第一颗粒，或者由于所述样品 中存在或缺乏分析物之故，该第一标记变得结合于第一颗粒。第一颗粒积聚在第一检测表 面处，以抑制电磁辐射经由该表面传播进入样品中以及从中传播出来。检测从该第一检测 表面发射出的电磁辐射的存在或其量。第一颗粒可由于施加于样品的力之故而积聚于检测 表面处，其中该力选自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力。在一个方面，标记结合于 颗粒，且由于样品中分析物的存在或缺乏之故而被释放。
[0012] 在进一步的实施方式中，本发明的方法包括向容器中添加发射电磁辐射的第二标 记以及至少形状、尺寸、密度、磁导率、电荷及光学涂层中至少之一而不同于第一颗粒的第 二颗粒，其中该第二标记结合于第二颗粒，或者由于所述样品中存在或缺乏第二分析物之 故，该第二标记变成结合于第二颗粒。第二颗粒积聚在第二检测表面处，以抑制电磁辐射经 由该第二检测表面传播进入样品中以及从中传播出来。检测在该第二检测表面处发射出的 电磁辐射的存在或量。在该实施方式的各种方面中，第一颗粒由于第一力而积聚于第一检 测表面处，而第二颗粒由于第二力而积聚于第二检测表面处，其中第一力和第二力独立选 自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力，并且其中第一力和第二力被同时或顺序施加 于样品。或者，第二颗粒可积聚在第一检测表面处，以抑制电磁辐射经由该第一检测表面传 播进入样品中以及从中传播出来，其中第一颗粒由于第一力而积聚于第一检测表面处，而 第二颗粒由于第二力而积聚于第一检测表面处，其中第一力和第二力独立选自重力、磁力、 电力、离心力、对流力和声学力，其中第一力和第二力被顺序施加于样品。可在该第一检测 表面处检测从第一颗粒和第二颗粒发射出的电磁辐射的存在或其量。
[0013] 仍更进一步，本发明涉及从生物元素的异源种群中检测靶标生物元素的方法。该 方法包括：将生物元素的异源种群分布到容器阵列中；向该阵列容器中添加颗粒和激活后 发射电磁辐射的第一标记，其中第一标记结合于第一颗粒，或者由于样品中的分析物存在 或缺乏之故第一标记变成结合于第一颗粒的；向阵列施加力，以使颗粒积聚于各容器中的 样品表面上；鉴定由容器发射的电磁辐射的存在或其量，从而鉴定出含有靶标生物元素的 容器。容器阵列可以是具有多个纵向融合的毛细管的微腔阵列，毛细管的直径为约1至约 500微米。另外，阵列可具有每平方厘米阵列约300-64, 000, 000个毛细管。样品可以以意 图在各容器中引入至多单个生物元素的浓度加至阵列中。
[0014] 在本发明的各种实施方式中，容器或器皿是具有检测表面的微腔，所述检测表面 是微腔中样品溶液的弯液面。可用于通过施加磁场混合样品，以使颗粒在样品溶液内移动， 其中颗粒是磁性的。
[0015] 另外，生物元素可以是微生物、细胞、蛋白质、核酸、脂类、糖类、代谢物或小分子。 例如，细胞产生重组蛋白，诸如酶或抗体。
[0016] 仍进一步，本发明涉及在微腔阵列中从与电磁辐射吸收材料相结合的单微腔中提 取包含生物元素的溶液。该方法包括将电磁辐射集中在微腔处以产生材料或样品的膨胀或 者样品的蒸发，这将至少部分样品从微腔中排出。在各种实施方式中，材料包括在微腔中的 颗粒，或者材料是至少部分涂覆或覆盖微腔的高热膨胀材料。
[0017] 附图简述
[0018] 图1是本文公开方法的代表性实施方式的示意图。
[0019] 图2图解了根据本公开使用的高密度阵列的一个实施方式的实例。
[0020] 图3图解了向阵列容器中添加或加载含分析物和其他生物元素的样品的一个实 施方式。
[0021] 图4图解了用于扫描并鉴定产生信号的孔的方法的一个实施方式。由于已标记颗 粒积聚于孔的检测表面出，这些孔表现为高强度斑点。在一个如本文所实施的测定设计中， 诸如夹心法，具有强信号的孔将被选择用于提取和进一步的制备。在如本文所实施的另一 测定设计中，诸如酶活性测定，不选择具有强信号的孔。反而，将选择显示最少信号或无信 号的孔。
[0022] 图5图解了颗粒抑制来自溶液中未结合于颗粒的标记的信号的能力。
[0023] 图6图解了蛋白质结合与检测测定可在如本文所公开的孔中直接进行。在该实施 方式中，阵列的所有孔包括荧光标记的（Atto 590)链霉亲和素和涂覆有生物素（A部分：正 对照）和寡聚（dT)25(01igo (dT)25) (B部分：负对照）的磁珠。
[0024] 图7展示了所公开方法在单细胞水平上的特异性。在该实施方式中，阵列的所有 孔包含表达重组蛋白质GFP的大肠杆菌细胞。各孔还含有涂覆有鼠抗-GFP抗体（正对照） 的磁珠和涂覆有寡聚（dT) 25(负对照）的磁珠。
[0025] 图8展示了本文公开的方法无需细胞溶解来进行分析物检测。在这些实施方式 中，阵列被加载表达重组蛋白质GFP的大肠杆菌细胞。各孔也含有荧光标记（Atto 590)，其 也结合于鼠抗-GFP抗体。两种正对照孔含有与抗GFP抗体结合的磁珠，但是一个阵列的孔 在检测前利用超声处理来溶解。负对照阵列利用产生处理溶解，且含有寡聚-dT珠，该珠普 遍抑制来自阵列中所有孔的信号。
[0026] 图9是一种单孔提取方法的示意图。
[0027] 图10展示了试剂、颗粒或其他分子可以被加至含细胞的阵列中或者从中去掉而 不会干扰细胞。在不打扰预加载ffiK 293细胞的情况下，将碘化丙啶（PI)加载到微孔中。 A部分：PI加载前，具有最小的背景信号。B部分：加载已经被插入无活性的HEK 293细胞 的弯液面中的PI之后。
[0028] 实施方式详述
[0029] 本发明涉及用于检测样品中的分析物的方法、装置和试剂盒。在各种实施方式中， 本发明涉及筛选生物元素大种群中生物元素亚种群或单一元素的存在或缺乏。本发明可用 于从数百万或数亿生物元素的异源种群中发现、表征和选择特异性相互作用。
[0030] 本发明利用生物测定技术，其中功能化颗粒积聚在样品容器的表面出并部分或完 全地物理抑制电磁辐射传播进入样品液中和/或从中传播出来。在【具体实施方式】中，通过 检测自每个腔中发射的电磁信号来筛选高密度微腔，例如微孔。可利用下述阵列实现高灵 敏度：该阵列的排列使得每个腔含有能够抑制进入每个腔和/或从中出来的电磁辐射（EM) 的单个或数个生物元素和微粒。通过使用微腔阵列和基于同源颗粒的测定，本发明的方法 提供规模性单细胞分析。该方法可用于在大的复合混合物中发现非常少的（|1〇 8之1)生 物元素，例如细胞。
[0031] 本发明提供优于其他生物元素种群筛选方法的若干优点。首先，其允许数百万、数 亿或更多的平行的生物相互作用的样品筛选。本发明还允许分析物（诸如靶细胞）的展示 和独立发现。另外，其平行地提供数亿克隆的浓度对亲和性信息（例如，对每个所表达基因 可提供对生产效率的反馈）。
[0032] 在一个实施方式中，公开了利用微腔阵列（例如多孔玻璃阵列）从数千、数百万 甚或数亿细胞克隆种群中选择产生亚种群抗体的生物细胞克隆（例如，单个或若干细胞克 隆）的方法。在一个实施方式中，微腔被填充含有具有抗体（或任何感兴趣蛋白质）产生 基因的生物细胞克隆的溶液（例如，培养基）。细胞使抗体在培养基中生长并表达，该抗体 可与固定于培养基内的颗粒上的结合配体反应并结合。通过向培养基中添加荧光试剂（例 如，荧光标记的抗-分析物抗体）可检测抗原-抗体复合物。
[0033] 在一个实施方式中，所述方法包括从微孔阵列中回收生物细胞。在一个实施方式 中，生物细胞包括产生荧光蛋白质的细胞。在一个实施方式中，生物细胞包括产生融合于非 焚光蛋白质的焚光蛋白质的细胞。
[0034] 本发明可用于分离任何类型的生物细胞，包括但不限于：表达或产生蛋白质类、糖 类、酶类、肽类、激素类、受体类的细胞系；产生抗体的其他细胞系；基因工程细胞；和激活 细胞。此外，本发明可用于筛选多种生物活性，包括但不限于：表面受体蛋白质的表达、酶生 产和肽生产。此外，本发明还用于筛选多种测试剂以测定该测试剂对所述生物活性的效果。 本领域技术人员将容易理解需要进行分离和筛选的其他类型的细胞、需要进行检测的其他 类型的生物活性以及待被筛选的特异性测试剂。
[0035] 定义
[0036] 除非另外定义，本文使用的技术和科学术语与本领域技术人员通常理解的具有相 同的含义。本文所提及的所有公开、专利申请、专利及其他参考文件如果没有例外指示，均 通过参考明确引入。
[0037] 如本文所用，单数形式"一个（〃&，〃〃&11〃）"和"该（〃也，）"，包括复数指代，除非 上下文明确另外指示。
[0038] 如本文所用，术语〃结合配体（binding partner) 〃、〃配体（ligand) 〃或〃受体 (receptor)"可以是任意大量的不同分子或聚集体，并且所述术语可互换使用。在各种实施 方式中，结合配体可与被检测的分析物缔合或结合。蛋白质、多肽、肽、核酸（核苷酸、寡核 苷酸和多核苷酸）、抗体、糖类、多糖、脂类、受体、测试化合物（特别是那些太过组合化学制 备的化合物）每个可以是结合配体。
[0039] 术语〃生物细胞〃是指来自生物体的任何细胞，包括但不限于病毒细胞、昆虫细 胞、微生物细胞、真菌细胞（例如，酵母）或动物（例如，哺乳动物）细胞。
[0040] 如本文所用，术语〃生物元素（biological element) "是指任何生物活性分子。 这些分子的非限定性实例包括蛋白质、核酸、肽、抗体、抗体片段、酶、激素、生物细胞和小分 子。
[0041] "分析物"通常指样品中的感兴趣元素，例如，生物样品中的感兴趣生物元素。 [0042] 如本文所用，术语〃结合〃或〃附着〃包括包括任何物理连接或紧密缔合，其可以 是永久性的或临时性的。这些物理连接或紧密缔合可以是相互作用。这些缔合的非限定性 实例为氢键合、疏水力、范德华力、共价键合和/或离子键合。这些相互作用可促进感兴趣 分子与被测量分析物之间的物理连接。"结合"相互作用可以是简短的，如在结合引发化学 反应发生的情况中，诸如例如，当结合组分是酶，而分析物是该酶的底物时。
[0043] 由结合剂与分析物之间的接触产生的特异性结合反应也在该定义内。此类反应是 例如抗体与例如蛋白质或肽之间的相互作用结果，使得该相互作用取决于蛋白质上特定结 构（例如，抗原决定簇或表位）的存在。换言之，抗体识别并结合于特异性蛋白质结构，而 非通常的蛋白质。例如，如果抗体对表位"A"具有特异性，则含表位A(或游离的未标记的 A)的蛋白质在含经标记"A〃和抗体的反应中的存在将降低结合于该抗体的经标记A的量。 特异性结合相互作用也可发生于其他分子之间，包括例如蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白 质-小分子相互作用、抗体_小分子相互作用以及蛋白质、糖类相互作用。这些相互作用中 的每一种可以发生于细胞的表面。
[0044] 术语〃阵列〃和〃微阵列〃可互换使用，区别通常仅在于大小。在各种实施方式 中，阵列通常含有多种（典型为100到超过1，〇〇〇, 〇〇〇)不同的反应空间，用于细孔、孔、腔、 内容器或贮器，其中各容器可位于已知的位置且含有单个或多个感兴趣组分。
[0045] 如本文所用，术语〃样品〃以其最宽含义使用，且包括环境和生物样品。环境样