粒。不含链霉亲和素的情 况下，与抗GFP抗体缀合的生物素不与磁性颗粒相互作用或者不与其结合。因此，磁性颗 粒、抗-GFP抗体和抗-GFP标记保留于溶液中。温育后，使阵列暴露于磁力，其将颗粒移动 至检测表面。EM辐射暴露后使阵列成像。因为寡聚-dT磁性颗粒未与任何标记结合，其因 此积聚至检测表面并抑制EM辐射到达溶液中的标记。该颗粒还可用于抑制检测器检测从 未结合于磁性颗粒的标记发出的EM辐射。如果量化来自各阵列的荧光的量，则来自特异性 抗GFP磁珠的发射充分高于负对照寡（dt)珠。
[0198] 因此，该实验显示如公开的磁珠抑制方法通过专门抑制孔信号能够选择含分析物 的孔。
[0199] 实施例3 :单细胞特异性检测
[0200] 下述实施例展示了所公开的方法用于检测单细胞水平的特异性。
[0201] 在该实施方式中，根据实施例2所述的步骤建立测定体系，只是在铺板细胞之前， 将细菌细胞稀释到300细胞/ y L，对其计算，在含直径20 y m的孔的阵列板上产生约0. 1细 胞/孔。当加至阵列时，该稀释在大部分孔中将至多产生单细菌细胞。
[0202] 如所述，将抗-GFP链霉亲和素珠和抗-GFP标记加至第一阵列。当磁珠积聚之后 EM辐射暴露于阵列时所见的相应信号示于图7A中。很多细胞产生信号，其代表来自经由 链霉亲和素-生物素键结合于抗GFP抗体的链霉亲和素磁珠的荧光信号。施加磁力后，仅 表达分析物靶蛋白（GFP)并因此使珠与标记结合的细胞提供正信号。然而，伴随单细胞稀 释同样观察到的是具有减小的信号或没有信号的孔。这些孔最可能缺乏任何GFP-产生细 胞和/或含有不再表达GFP的细菌细胞。因此，没有标记结合于磁性颗粒，而且是施加磁力 时，磁性颗粒抑制检测表面。
[0203] 因此，含寡（dt)25珠的另一阵列描述了来自孔的非常少的荧光信号，如图7B所示。 在该阵列中，不存在结合于珠的抗-GFP抗体。施加磁力后，表达分析物靶蛋白（GFP)的细 胞无一提供信号，因为磁珠已经积聚到无标记的检测表面。在该设置中，来自EM源的EM辐 射不能到达这些孔的溶液中的未结合标记。因此，在该阵列中没有观察到信号。磁珠也可 能积聚在样品与检测器之间，以抑制从标记向检测器的发射。
[0204] 实施例4 :检测无需细胞的溶解
[0205] 该实施例显示了利用阵列中的珠进行夹心免疫测定无需细胞溶解来进行分析物 检测
[0206] 在这些实施方式中，如先前实施例所述般制备阵列，其中两个正队长阵列含有连 接于抗-GFP抗体的磁珠。一个正对照阵列的细胞在检测之前利用超声处理在5瓦特下进 行细胞溶解1.5分钟，采用具有微板角（Microplate horn)的Misonix 4000,而另一正对照 阵列未进行细胞溶解。
[0207] 负对照阵列含有寡聚-dT珠，较早的实施例已经显示在其抑制该阵列体系中来自 所有孔的信号。负对照阵列利用与正对照阵列相同的超声处理条件进行细胞溶解。结果表 明（见图8A-C)，基于像素数的量化，与细胞溶解（超声处理）步骤无关，两种正对照阵列具 有类似的信号水平。此外，细胞溶解步骤没有去除颗粒抑制的选择性，因为负对照珠仍保持 远低于正对照水平，图8A和8B。这表明，对于某些表达机制，细胞溶解对于利用本文所述的 方法检测分析物是不需要的。
[0208] 实施例5 :细胞的提取和回收
[0209] 下述实施例展示了单靶标在数亿靶细胞中的展示及独立回收。
[0210] 在本实施例中，如实施例2所述制备细胞、珠、标记和阵列。在鉴定出一个或多个 含分析物的孔之后，提取单孔中的溶液是期望的。
[0211] 如图9中所述和所绘，将阵列置于固定器上，使得孔阵列在捕捉表面上是约 80 y 1 (Sylgard?184Silicone Elastomer Kit, Dow Corning)。固定器由载玻片构 成（12-550-14，Fisher Scientific)，其具有250 ym厚的捕捉表面，位于捕捉表面各 侧上的两个80 ym胶带间隔物。将孔阵列置于固定器上之后，阵列的上侧用塑料包装 (22_3〇5654, Fisher Scientific)密封。
[0212] 对于回收，选择感兴趣孔，诸如高强度孔。然后通过在20-30%强度功率下聚焦 349 y m固态UV激光并发射20 y J脉冲，提取该孔。然后可将自靶标孔提取的细胞置于捕捉 表面上，如图9所示。
[0213] 提取后，从大角星激光捕获显微解剖系统移走固定器和阵列，并将含有已提取细 胞的捕捉表面置于5mL LB+25μg/ml KAN培养基中并在摇床中于37°C温育19小时，以扩展 已提取细胞。这些表达感兴趣蛋白质的细胞然后准备用于任何类型的扩大化蛋白质制备和 /或进一步的处理。
[0214] 实施例6 :修改阵列孔中的试剂浓度
[0215] 下述实施例展示了试剂和其他分子（诸如磁珠）可在阵列被加载之后加至其中而 不会干扰该阵列内的细胞。
[0216] 在该实施方式中，将含有人胚肾293的Freestyle 293培养基以浓度2, 500细胞 / y L加至孔径100 y m为的微孔阵列中。这加载了约20细胞/孔，且细胞活力为约50 %。 首先利用荧光显微镜在l〇x下成像细胞，采用德克萨斯红滤光器块，测量该通道中的任何 背景荧光（图10A)，接下来，将含有2 y g/mL碘化丙啶（PI)的50 y L培养基滴置于微孔阵 列顶部。在660道尔顿，PI是相对小的分子并且室温下在水溶液中60秒内扩散约400 ym。 因为微孔约1mm长，因此在微孔底部所加载的细胞5分钟后应当暴露于PI分子。这通过在 未存活HEK 293细胞的核中检测到PI分子插入DNA而得到证实，如图10B所示。
[0217] 其他实施方式：下述其他实施方式是非限定性的，其呈现于此以进一步举例说明 本公开的各方面：
[0218] 一种用于检测靶生物元素的装置，包括：
[0219] 微孔阵列，其内径为约1 ym至约500 ym，
[0220] 磁源，其向所述阵列施加磁场，
[0221] 电磁辐射源，其向所述阵列施加电磁辐射，和
[0222] 检测器，其接收来自所述阵列的电磁辐射并鉴定发出辐射的至少一个微孔的位 置。
[0223] 所述装置还包括在所述阵列的各孔中包含结合配体的磁性颗粒。
[0224] 所述装置还包括将能量聚集在发出电磁辐射的微孔上的能源。
[0225] 该装置的微孔不是透明的。
[0226] 微孔被涂覆阻止孔之间的光传播的材料。
[0227] 一种用于检测分析物的试剂盒，包括：微孔阵列，其包括多个直径为约1 ym至约 500 y m的纵向熔合纤维，以及磁性颗粒，其包含分析物的结合配体。
[0228] 微孔不是透明的。
[0229] 微孔被涂覆阻止孔之间的光传播的材料。
[0230] 尽管本发明的各种【具体实施方式】已经在本文进行描述，应理解，本发明不限于那 些精确的【具体实施方式】，而且各种改变或修饰可在其中受本领域技术人员影响，而不背离 本发明的范围和精神。
[0231] 应理解，本发明不限于本文所述的特定的方法、方案和试剂等，因为如本领域技术 人员会意识到的，这些可能会变化。还应理解本文使用的术语使用目的是仅仅在于描述特 定实施方式，而非意图限定本发明的范围。
[0232] 应注意附图中所图解的特征不必按比例绘制，而且一个实施方式的特征可用于其 他实施方式，这是本领域技术人员理解的，即使本文未明确陈述。
[0233] 本文所述的任何数值包括从下限值到上限值以一个单位递增的所有值，条件是在 任意下限值与任意更高值之间存在至少两个单位的间隔。作为示例，如果记载了组分的浓 度或工艺变量（诸如例如尺寸、角度大小、压力、时间等）的值，为例如1-90,具体为20-80， 更具体为30-70,则意在诸如15-85、22-68、43-51、30-32等的值均明确列举与该说明书中。 对于小于1的变量，一个单位被认为是0. 〇〇〇l、〇. 〇〇l、〇. 01或0. 1，视情况而定。这些仅仅 是特别有意的示例，在下限值与上限值之间的所有可能的树脂组合被认为是以类似方式清 楚地记载于本说明书中。
[0234] 本文引用的所有参考文献和出版物的公开以其整体通过残留明确引入，其程度等 同于每一篇均通过参考单独引入。
【主权项】
1. 一种用于检测样品中的分析物的方法，包括： 向含样品溶液的反应容器中添加第一颗粒和发射电磁福射的第一标记，其中所述第一 标记结合于所述第一颗粒，或者由于所述样品中存在或缺乏所述分析物之故，所述第一标 记变成结合于所述第一颗粒， 使所述第一颗粒积聚在第一检测表面处，以抑制电磁辐射经由所述表面传播进入样品 中以及从中传播出来，及 检测从所述第一检测表面发出的电磁辐射的存在或其量。2. 如权利要求1所述的方法，其中所述容器包括微腔且所述第一表面包括所述样品溶 液的第一弯液面。3. 如权利要求1所述的方法，其中所述标记由于所述样品中所述分析物存在或缺乏的 结果而从所述颗粒释放。4. 如权利要求1所述的方法，其中所述第一颗粒由于施加于所述样品的力之故而积聚 于所述检测表面处，其中所述力选自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力。5. 如权利要求2所述的方法，还包括通过施加磁场以移动所述样品溶液中的所述第一 颗粒来混合所述样品，其中所述第一颗粒是磁性的。6. 如权利要求1所述的方法，还包括： 向所述容器中添加发射电磁辐射的第二标记以及基于下述性能中至少一种而不同于 所述第一颗粒的第二颗粒：形状、尺寸、密度、磁导率、电荷及光学涂层，其中所述第二标记 结合于所述第二颗粒，或者由于所述样品中存在或缺乏第二分析物之故，所述第二标记变 成结合于所述第二颗粒； 使所述第二颗粒积聚在第二检测表面处，以抑制电磁辐射经由该第二检测表面传播进 入样品中以及从中传播出来；及 检测在该第二检测表面处发出的电磁辐射的存在或其量。7. 如权利要求6所述的方法，其中所述第一颗粒由于第一力而积聚于所述第一检测表 面处，而第二颗粒由于第二力而积聚于所述第二检测表面处，其中所述第一力和第二力独 立选自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力，并且其中所述第一力和第二力被同时或 顺序施加于所述样品。8. 如权利要求1所述的方法，还包括： 向所述容器中添加发射电磁辐射的第二标记以及基于下述性能中至少一种而不同于 所述第一颗粒的第二颗粒：形状、尺寸、密度、磁导率、电荷及光学涂层，其中所述第二标记 结合于所述第二颗粒，或者由于所述样品中存在或缺乏第二分析物之故，所述第二标记变 成结合于所述第二颗粒； 使所述第二颗粒积聚在所述第一检测表面处，以抑制电磁辐射经由该第一检测表面传 播进入所述样品中以及从中传播出来，其中所述第一颗粒由于第一力而积聚于所述第一检 测表面处，而第二颗粒由于第二力而积聚于所述第一检测表面处，其中所述第一力和第二 力独立选自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力，并且其中所述第一力和第二力被顺 序施加于所述样品；及 检测从该第一检测表面发出的电磁辐射的存在或其量。9. 从生物元素的异源种群中检测靶标生物元素的方法，包括： 将所述的生物元素的异源种群分布到容器阵列中； 向该阵列中添加颗粒和激活后发射电磁辐射的第一标记，其中所述第一标记结合于 第一颗粒，或者由于所述样品中的分析物存在或缺乏之故所述第一标记变成结合于第一颗 粒； 向所述阵列施加力，以使所述颗粒积聚于各容器中的样品表面上；及 鉴定由所述容器发射的电磁辐射的存在或其量，从而鉴定出含有靶标生物元素的容 器。10. 如权利要求9所述的方法，其中由于样品中所述分析物存在或缺乏之故所述标记 自所述第一颗粒释放。11. 如权利要求9所述的方法，其中所述生物元素是生物体、细胞、蛋白质、核酸、脂质、 糖、代谢物或小分子。12. 如权利要求9所述的方法，其中所述细胞是产生重组蛋白质的转化细胞。13. 如权利要求10所述的方法，其中所述重组蛋白质是酶，且所述标记是所述酶的底 物。14. 如权利要求10所述的方法，其中所述细胞是产生重组抗体的转化细胞。15. 如权利要求9所述的方法，其中所述样品以意图在各容器中引入至多单个生物元 素的浓度加至所述阵列中。16. 如权利要求9所述的方法，其中所述容器阵列包括具有多个纵向融合的毛细管的 微腔阵列，所述毛细管的直径为约1至约500微米。17. 如权利要求15所述的方法，其中所述阵列包括每平方厘米阵列约300-64, 000, 000 个之间的毛细管。18. 如权利要求15所述的方法，其中所述微腔的侧壁不是透明的。19. 如权利要求16所述的方法，其中通过将包含试剂的流体引入所述阵列的顶部而将 所述试剂加至所述阵列。20. 在微腔阵列中从单微腔中提取包含生物元素的溶液，其中，各微腔与电磁辐射吸收 材料相结合，所述方法包括： 将电磁辐射集中在所述微腔处以产生所述材料或样品的膨胀或者所述样品的蒸发，这 将至少部分样品从所述微腔中排出。21. 如权利要求20所述的方法，其中所述材料包括在微腔中的颗粒，或者所述材料包 括至少部分涂覆或覆盖所述微腔的高热膨胀材料。22. 如权利要求20所述的方法，其中所述至少部分样品被排出到吸湿性捕获表面。
【专利摘要】本发明提供了一种检测样品中的一种或多种分析物的方法。所述方法至少部分基于添加至该样品中的功能化颗粒部分地或完全地抑制电磁辐射经过含该样品的反应容器中的检测表面而传播到样品中及从中传播出来的能力。以微阵列形式，本发明能够用于筛选数百万、数亿或者更多的生物元素，诸如生物体、细胞、蛋白质、核酸、脂质、糖、代谢物或小分子。本发明还描述了方法、装置和试剂盒。
【IPC分类】C40B30/00, G01N33/543, C40B30/10
【公开号】CN104995513
【申请号】CN201380045761
【发明人】I.K.迪莫, T.M.贝尔
【申请人】里兰斯坦福初级大学理事会
【公开日】2015年10月21日
【申请日】2013年6月26日
【公告号】EP2870244A2, US20140011690, WO2014008056A2, WO2014008056A3