兴趣化合物从细胞中分泌并与结合配体结合。因此，在每个微孔 内部或之间可进行多种生物识别测定。例如，一种此类识别测定可包括抗原-抗体结合。
[0152] 在一个实施方式中，本发明考虑一种用于抗原-抗体结合的方法，包括在37°C将 多个细胞温育1 _ 24小时，使得每个孔产生抗体并将抗体分泌到微孔中。在一个实施方式 中，抗体是重组抗体。在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一个实施方式中，至少一 种细胞产生不止一种抗体。尽管理解本发明的机制不是必需的，但是认为由于微孔的结构， 这种温育已经降低了蒸发损失，这是由于孔的入口很窄（因此，暴露的表面积小）以及其非 常长所致。在一个实施方式中，抗体受到诱导剂的刺激。在一个实施方式中，诱导剂包括 IPTG。见图 3。
[0153] 治疗药物的发现
[0154] 在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定新治疗药物的方法。例如，颗粒可用 已知参与疾病状况的药物结合配体（即，例如，生物受体和/或酶）涂覆。然后利用该极高 密度微孔阵列筛选多个细胞，所述细胞分泌多种疑似对结合配体具有亲和性的化合物。选 择含有附着至具有最高亲和性的结合配体-化合物复合物的颗粒的微孔，用于进一步的开 发。
[0155] 诊断抗体的发现
[0156] 在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定诊断抗体的方法。例如，颗粒可用已 知参与疾病状况的结合配体（即，例如，抗原和/或表位）涂覆。然后利用该极高密度微孔 阵列筛选多个细胞，所述细胞分泌多种疑似对结合配体具有亲和性的抗体。选择含有附着 至具有最高亲和性的结合配体-抗体复合物的颗粒的微孔，用于进一步的开发。
[0157] 蛋白质_蛋白质相互作用研宄
[0158] 在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定蛋白质-蛋白质相互作用的方法。 例如，颗粒可用已知参与疾病状况的结合配体（即，例如，蛋白质和/或肽）涂覆。然后利 用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所述细胞分泌多种疑似对结合配体具有亲和性的蛋 白质和/或肽。选择含有具有固定化的亲和性最高的结合配体-蛋白质或肽复合物的颗粒 的微孔，用于进一步的开发。
[0159] 蛋白质-核酸相互作用研宄
[0160] 在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定蛋白质_核酸相互作用的方法。例 如，颗粒可用已知参与疾病状况的结合配体（即，例如，脱氧核糖核酸和/或核糖核酸和/ 或SOMAmer和/或核酸适配体）涂覆。然后利用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所述 细胞分泌多种疑似对结合配体具有亲和性的蛋白质和/或肽。选择含有具有固定化的亲和 性最高的结合配体-核酸复合物的颗粒的微孔，用于进一步的开发。
[0161] 蛋白质-糖类相互作用研宄
[0162] 在一个实施方式中，本发明考虑一种包括鉴定蛋白质_糖类相互作用的方法。例 如，颗粒可用已知参与疾病状况的结合配体（即，例如，寡糖和脂质糖（liposaccharide)， 或蛋白糖（proteosaccharide))涂覆。然后利用该极高密度微孔阵列筛选多个细胞，所述 细胞分泌多种疑似对结合配体具有亲和性的外源凝集素、蛋白质和/或肽。选择含有具有 固定化的亲和性最高的结合配体-糖类复合物的颗粒的微孔，用于进一步的开发。
[0163] 蛋白质检测
[0164] 本文公开了是利用高度灵敏性体系从生物元素的异源种群来鉴定蛋白质分析物。 所公开的方法和体系提供了用于蛋白质工程的新型且重要的工具。具体而言，本文公开的 应用应导致发现新抗体的时间从14天显著降低带1-2天。在其他实施方式中，通过测量蛋 白质或多肽的表达可检测基因表达。
[0165] 在一个实施方式中，所公开的方法用于检测蛋白质分析物。具体分析物蛋白质的 检测可在阵列的孔中直接进行。当颗粒聚集在孔的检测表面上之后，获取图像，使得背景信 号得以抑制。
[0166] 生物化学传感可利用标准检测技术进行，包括夹心免疫测定或类似的集合或杂交 反应。结合磁性颗粒，与任选被标记（例如，附着至荧光色素）的二次抗体一起加载培养基。
[0167] 如果元素产生的靶蛋白与附着至颗粒表面的抗原结合的话，则二次抗体与颗粒结 合（见图3A)。为最大化靶蛋白与抗体的结合能力，通过定期（例如，约每20分钟）将磁性 颗粒暴露于磁场使其保持悬浮，以使颗粒遍及样品体积中所含的液体循环。
[0168] 核酸检测
[0169] 在一个实施方式中，分析物是核酸。例如，通过任何合适的方法可测量DNA或 mRNA表达。例如，通过特定结构的酶裂解检测RNA表达（丨INVADER 1，〗定，Third Wave Technologies ;见例如美国专利号 5, 846, 717 ;6, 090, 543 ;6, 001，567 ;5, 985, 557 ;和 5, 994, 069 ;其中各篇通过参考引入本文）。通过使用结构特异性酶来裂解由重叠寡核苷酸 探针杂交所形成的复合物，INVADFH^检测特定核酸（例如，RNA)序列。
[0170] 在仍进一步的实施方式中，通过与寡核酸酸探针杂交检测RNA(或相应的cDNA)。 利用多种技术进行杂交和检测的多种杂交测试是可用的。例如，在一些实施方式中，利用 丁八()^/1八]^测定（?￡81〇878七61118，？〇8七61'(：行7,〇311€ ;见例如美国专利号5,962,233和 5, 538, 848,其中各篇通过参考引入本文）。在PCR反应过程中进行该测定。TaqMan测定利 用八^11：5〇丁八()' <60〇)0嫩多聚酶的5'-3'外切核酸酶。由寡核苷酸与5'-报告染料（例 如，荧光染料）和3'-猝灭染料组成的探针包括在PCR反应中。在PCR过程中，如果探针与 其靶标结合，则AMPLITAQ?GOLD多聚酶的5' -3'核溶解活性裂解报告染料与猝灭染 料之间的探针。报告染料与猝灭染料的分离导致荧光增加。随着每个PCR循环信号积聚并 能用荧光剂监控。
[0171] 还在其他实施方式中，逆转录酶PCR(RT-PCR)用于检测RNA的表达。在RT-PCR中， 利用逆转录酶RNA被酶促转化成互补DNA或〃cDNA〃。cDNA然后用作PCR反应的模板。PCR 产物可通过任何合适的方法来检测，包括但不限于凝胶电泳法，以及用DNA特异性染色进 行染色，或者与标记探针杂交。在一些实施方式中，利用定量逆转录酶PCR，其含有美国专利 号5, 639, 606、5, 643, 765和5, 876, 978 (其中各专利通过参考引入本文）中所述的竞争性 模板方法的混合物。
[0172] 细胞检测
[0173] 在另一实施方式中，分析物是生物细胞。在一个实施方式中，分析物是至少一种生 物细胞。
[0174] 本文公开的检测可用于分离任何类型的生物细胞，包括但不限于：表达或产生蛋 白质类、糖类、酶类、肽类、激素类、受体类的细胞系；产生抗体的其他细胞系；基因工程细 胞；和激活细胞。此外，本发明可用于筛选多种生物活性，包括但不限于：表面受体蛋白质 的表达、酶生产和肽生产。此外，本发明还用于筛选多种测试剂以测定该测试剂对所需生物 活性的效果。本领域技术人员将容易理解需要进行分离和筛选的其他类型的细胞、需要进 行检测的其他类型的生物活性以及待被筛选的特异性测试剂。
[0175] 在【具体实施方式】中，生物细胞是经转化的生物细胞。细胞的转化可通过任何熟知 的方法利用任何熟知的载体（诸如例如质粒或病毒）产生。
[0176] 在一个实施方式中，生物细胞是微生物、真菌、哺乳动物、昆虫或动物细胞。在一个 实施方式中，生物细胞是细菌细胞。在一个实施方式中，生物细胞是大肠杆菌细胞。
[0177] 在一个实施方式中，动物细胞包括稀有生物化学化合物。在一个实施方式中，生物 化学化合物选自蛋白质、肽、激素、核酸、糖类。
[0178] 在另一实施方式中，生物细胞产生和/或表达荧光蛋白质。在又一实施方式中，生 物细胞产生荧光蛋白质（例如GFP)。 实施例
[0179] 提供下述实施例阐述但非限定所要求保护的发明。
[0180] 实施例1 :磁珠信号阻断
[0181] 该实施例展示了磁珠抑制来自溶液中未与颗粒结合的标记的高背景信号的能力。
[0182] 用10 y M Alexa 488焚光色素（Sigma Aldrich)作为标记以及2. 8 y m磁性颗粒 加载干净且干燥的20 ym孔径的阵列板（J5022-19, Hamamatsu Photonics K. K.)，使得各孔 都接收标记可磁性颗粒。单独的荧光色素不与磁珠颗粒结合或缔合。
[0183] 阵列孔在检测之前不暴露于任何动力，这样磁性颗粒和标记都保留在溶液中。温 育后，使包含磁性颗粒和标记的此阵列经受EM辐射，并利用显微镜使来自标记的荧光发射 成像。正如预期的，如在图5A中所示，所有孔显示显著信号，因为溶液中的未结合标记对EM 辐射完全暴露。利用CDC相机捕捉荧光图像。当量化像素数和强度时，信号显示适宜强度 下的像素数为约4xl0 5。因此，在缺乏颗粒积聚的情况下，溶液中的未结合标记将在几乎所 有孔中发出信号，而不管其内含物如何。
[0184] 接下来，在同一阵列中，通过在阵列的底部（3mm内）放置10mm立方体钕磁铁 (B666，K&J Magnetics Inc.) 60秒，将磁性颗粒积聚到阵列的各反应容器的检测表面（例 如，该实施例中的弯液面0。在颗粒已经积聚之后，捕捉相同位置的另一荧光图像。如图 5B所示，图像在带信号的孔中显示显著的减小。的确，几乎所有孔都已经失去或减小了其信 号。当量化信号时，在积聚阵列中适宜强度下的信号降至零。来自未结合标记的信号被磁 珠抑制，而且仅有来自阵列的基础自发荧光保留。惊人地，颗粒在样品检测表面处的积聚代 表了从各孔的未结合标记消除背景信号的新策略。
[0185] 实施例2:测定制备
[0186] 该实施例提供了检测分析物在阵列中存在或缺乏情况的代表性测序体系。最终筛 选涉及当然将取决于该实验及其目标特定的很多因素
[0187] 在该测定中使用大肠杆菌菌株Imp4213,其含有表达GFP的质粒。将约1.0百万至 1千万GFP-表达细菌细胞加至5mL含25 y g/ml卡那霉素（KAN)的肉汤（LB)培养基中并在 摇床（200RPM)在37°C膨胀（expand)约3小时，直到细菌进入指数生长期，然后准备铺板。
[0188] 本实施例中所用的颗粒是磁珠。具体而言，对于这些实施例，所用的颗粒是 与链霉亲和素（料号ll 2-〇5D, Invitrogen, Carlsbad, CA)或寡聚（dt)25配体（料号 610-05, Invitrogen, Carlsbad, CA)结合的 2. 8 ym直径的磁珠（Dynabeads)。将磁珠用生物 素化的兔抗-GFP抗体（A10259, Invitrogen, Carlsbad, CA)温育约30分钟，这使抗GFP-抗 体经由生物素-链霉亲和素相互作用与磁珠结合。因此产生抗-GFP磁珠。
[0189] 在该实施例中，在细胞加至阵列之前，用磁珠和标记补充细胞。将磁珠（抗-GFP 珠检测分析物，或者寡（dt) 25珠作为负对照）加至浓度30mg/ml。通过使15 y g/ml生物素 化兔抗-GFP(A10259, Invitrogen, Carlsbad, CA)缀合至链霉亲和素（40709-1MG-F, Sigma Aldrich)的荧光色素Atto 590组合（其形成荧光标记的抗-GFP抗体），产生标记。对于 该测定，可使用任何荧光团标记，只要其不在与GFP相同的波长附近发射EM辐射。
[0190]通过将液滴置于阵列上并将分析混合物铺展到阵列板表面至约1 y 1/mm2 (图3)， 将细胞加至干净且干燥的20 ym孔径的阵列板（J5022-19, Hamamatsu Photonics K.K.)。 同时将混合物经过亲水性孔表面分配至孔中。
[0191] 分配样品后，将阵列板置于固定器上，使得孔阵列板在捕捉表面之上是 80 y 1 (Sylgard?184Silicone Elastomer Kit, Dow Corning)。固定器由载玻片构 成（12-550-14，Fisher Scientific)，其具有250 ym厚的捕捉表面，位于捕捉表面各 侧上的两个80 ym胶带间隔物。将孔阵列置于固定器上之后，阵列的上侧用塑料包装 (22-305654, Fisher Scientific)密封。将完整设备置于100mm培养皿中，该培养皿具有两 个10_去离子水湿润的棉纸球，用于湿度饱和。用保鲜膜密封培养皿并将其在37°C温育 19小时。
[0192] 为选择含分析物的孔，通过在阵列的底部（3mm内）放置10mm立方体钕磁铁 (B666，K&J Magnetics Inc.) 60秒，将磁性颗粒积聚到孔阵列的底表面。然后将固定器上 阵列加载到大角星激光捕获显微解剖系统Arcturus Laser Capture Microdissection System(型号：Veritas，Applied Biosystems, USA)中以促进检测。
[0193] 为检测含分析物的孔的荧光，通过用显微镜（其包括20x物镜和594nm激发， 630nm发射荧光盒）读取孔阵列板的底表面荧光，扫描免疫测定结果。利用CCD相机进行图 像捕捉。
[0194] 实施例3 :检测阵列中的分析物
[0195] 该实施例阐述了利用本文公开的方法可直接在孔中进行蛋白质结合和检测测定。 在该实施方式中，根据实施例2中所述的步骤建立测定体系。
[0196] 第一阵列含有孔，该孔包含如实施例2所述而产生的抗-GFP磁性颗粒和抗-GFP 标记。温育后，如所述，使阵列暴露于磁力，其将颗粒移动至样品的检测表面，在该实施例中 该检测表面是各阵列容器的弯液面。捕捉该阵列的图像。抗-GFP磁性颗粒与靶蛋白结合 (GFP)，该靶蛋白也被抗-GFP标记结合。磁力将所标记的颗粒移动至检测表面，从而将发射 信号的标记集中在检测表面处并抑制未结合的标记向检测器或显微镜发射EM辐射。这种 相互作用在孔内的示意图示于图1B中。
[0197] 第二阵列含有与配体寡聚_dT而非链霉亲和素结合的颗