粒在至 少一种下述性能方面的可变的：形状、尺寸、密度、磁导率、电荷及光学涂层。作为样品中第 二分析物存在或缺乏的结果，第二标记因此能够与第二颗粒缔合并利用如下所述的动力来 处理。
[0078] 在另一实施方式中，颗粒非特异性结合样品组分。例如，颗粒能够被官能化，以便 非特异性结合样品中的所有蛋白质，这允许对阵列中的样品之间的蛋白质含量归一化。
[0079] 抗体
[0080] 如本文所用的，术语〃抗体〃是广义术语并以其常规含义使用，其无限制地包括天 然出现的抗体以及非天然出现的抗体，包括例如单链抗体、嵌合抗体、双功能抗体以及人源 化抗体，以及其抗原结合片段。应理解，抗体形成以针对的分子的表位或区域的选择将确定 其对例如各种形式的分子（如果存在）的特异性，或者对全部（例如，所有或基本所有）分 子的特异性。
[0081] 生产抗体的方法已经建立。本领域技术人员将意识到很多方法可用于制备抗 体，例如如 Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)，Cold Spring Harbor, N. Y.中所述。本领域技术人员还 将理解，模拟抗体的结合片段或Fab片段可通过各种方法从遗传信息制备（Antibody Engineering:A Practical Approach (Borrebaeck, C.,ed. ), 1995, Oxford University Press, Oxford ;J. Immunol. 149, 3914-3920(1992))。针对分子（例如蛋白质）和标记物 的单克隆和多克隆抗体也是商业可得的（R and D Systems, Minneapolis, Minn. ;HyTest Ltd. , Turk, Finland ；Abcam Inc. , Cambridge, Mass. , USA, Life Diagnostics, Inc. , West Chester, Pa. , USA ；Fitzgerald Industries International, Inc. , Concord, Mass. , USA ；Bi osPacific, Emeryville, Calif. ) 〇
[0082] 在一些实施方式中，抗体是多克隆抗体。在其他实施方式中，抗体是单克隆抗体。
[0083] 捕获结合配体和检测结合配体对，例如捕获和检测抗体对，可用于本发明的实施 方式中。因此，在一些实施方式中，使用异源测定方案，其中，通常使用两种结合配体，例 如两种抗体。一种结合配体是捕获配体，通常固定在颗粒上，而另一种结合配体是检测结 合配体，通常带有附着的可检测标记。此类抗体对得自几种商业来源，诸如BiosPacific、 Emeryville、Calif。抗体对还可以通过本领域熟知的方法设计和制备。
[0084] 在【具体实施方式】中，抗体是生物素化的或生物素标记的。在另一实施方式中，抗体 是抗-GFP。
[0085] 在一个实施方式中，存在第二成像组分，其非特异性结合感兴趣分析物的所有成 员。因此，可读取这种信号，以归一化孔与孔之间的荧光量。一个实例是会在N或C端结合 所有蛋白质的抗体。对于对照组分而言，与靶标元素结合的微粒可被积聚在一个检测表面 处，而与对照元素结合的微粒积聚在另一检测表面处。或者，通过利用微粒中的差异（该差 异允许微粒在不同时间处于表面上），能够在同一表面上检测结合靶标和对照的微粒。因 此，在检测窗口对标记进行检测可顺序发生。
[0086] 标记
[0087] 可用于标记结合配体以便能够在颗粒混合物中进行其检测或区分的数种策略在 本领域是熟知的。可通过任何已知的手段附着标记，包括利用非特异性或特异性相互作用 的方法。另外，可直接或经由结合配体来完成标记。
[0088] 来自部分的发射（例如荧光）应足以使得利用检测器进行检测，如本文所述。通 常，本发明的组合物和方法利用高度荧光部分，例如当在该部分的激发波长下被电磁辐射 源刺激时能够发射电磁辐射的部分。若干种部分适合本发明的组合物和方法。
[0089] 通过电磁辐射之外的能量可激活的标记也可用于本发明。此类标记例如可通过 电、热或化学反应（例如，化学发光标记）激活。同样，多种酶促激活标记是本领域技术人 员熟知的。
[0090] 通常，所述部分的荧光涉及量子效率与缺乏光褪色的组合，从而足够使得所述部 分在所公开的检测器中在背景值之上是可检测的，且具有所需的检测极限、精确度和测定 精度所需的一致性。
[0091] 此外，所述部分具有与其在所选测定中的应用一致的性能。在一些实施方式中， 测定是免疫测定，其中荧光部分附着至抗体；该部分必须具有下述性能，该性能使其不会与 其他抗体或蛋白质聚集，或者使其不会产生比与所需精确度和测定精度相一致的聚集更多 的聚集。在一些实施方式中，荧光部分使分子染色，所述分子具有下述的组合：1)高吸收系 数；2)高量子产率；3)高耐光性（低光漂白）；和4)与标记感兴趣分子（例如，蛋白质）的 相容，以便其可利用本发明的分析仪和体系来分析（例如，不会引起感兴趣蛋白质的沉淀， 或者已经附着了该部分的蛋白质的沉淀）。
[0092] 荧光部分可包括单一实体（量子点或荧光分子）多个实体（例如，多个荧光分 子）。应理解，当"部分"（如该术语用于本文中）是指一组荧光实体（例如多个荧光染料 分子）时，每个实体可单独附着至结合配体，或者该实体可附着在一起，只要该实体作为一 组提供待被检测的足够荧光。
[0093] 在一些实施方式中，荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鑰（indolium)环体 系，其中该吲哚鑰环体系3-碳上的取代基含化学活性基团或共轭物质。实例包括Alexa Fluor分子。
[0094] 在一些实施方式中，标记包含第一类型的标记和第二类型的标记，诸如两种不同 的ALEXA FLUOR?染料（Invitrogen)，其中第一类型的染料分子和第二类型的染料分 子具有不同的发射光谱。
[0095] 用于荧光部分中的有用的荧光实体的非涵盖性名单包括：ALEXA FLUORA488、 ALEXAFLUOR?：532,ALEXAFLUOR?647.ALEXAFLUOR?700.ALEXAFLUOR?750, 荧光素、B-藻红蛋白、别藻蓝蛋白、PBXL-3、Atto 590和Qdot 605。
[0096] 标记可通过本领域已知的任何方法被附着至颗粒，包括吸收、共价键和、生物素/ 链霉亲和素或其他结合对。另外，标记可通过连接体附着。在一些实施方式中，标记被分析 物裂解，从而从颗粒中释放标记。或者，分析物可防止连接体裂解。
[0097] 阵列
[0098] 在一个实施方式中，用于本发明的反应容器包含在极度密集的多孔阵列中。例如， 在本文中考虑的微孔阵列可通过捆扎数百万或数亿硅石毛细管并通过热工艺将其熔合在 一起来制造。这类熔合过程包括下述步骤，其包括但不限于：i)加热在拉力下被拉成单包 层纤维的毛细管单拉制玻璃；ii)通过捆扎、加热和拉伸从该单拉制玻璃产生毛细管多拉 制单毛细管；iii)通过额外的捆扎、加热和拉伸从该多拉制单毛细管产生毛细管多-多拉 制多毛细管；iv)通过在压块中堆叠从该多=多拉制多毛细管产生拉制玻璃的分段装配； V)通过利用热和压力处理从该分段装配产生块状压块；及Vi)通过以精确长度（例如， 1mm)切割该块状压块产生块成块（block forming block)。
[0099] 在一个实施方式中，所述方法还包括切开硅石毛细管，从而形成非常高密度的玻 璃微孔阵列板。应理解，用于本发明的微孔阵列可通过任何合适的方法形成。在一个实施方 式中，毛细管被切割成约1mm的高度，从而形成内径在约1. 〇微米与500微米之间的多个微 孔。在一个实施方式中，微孔在约10微米与1毫米的长度之间变动。在一个实施方式中， 微孔在约10微米与1厘米的长度之间变动。在一个实施方式中，微孔在约10微米与10毫 米的长度之间变动。在一个实施方式中，微孔在约10微米与100毫米的长度之间变动。在 一个实施方式中，微孔在约〇. 5毫米与1米的长度之间变动。
[0100] 此类方法形成可用于本发明中的非常高密度的微孔阵列。在示例性阵列中，各微 孔具有5 ym直径和约66%开放空间（即，表不每个微孔的内腔）。在一些阵列中，开放阵 列的比例范围在约50%至约90%之间，例如，约60至75%，诸如Hamamatsu提供的微孔阵 列具有约67%的开放区域。在一个具体实例中，具有约5 ym直径微孔和约66%开放空间 的10x10cm阵列具有约33亿微孔。见例如图2。
[0101] 在各种实施方式中，微孔内径在约1. 〇微米与500微米之间的范围内。在一些阵列 中，所述微孔的每一个可具有在约1. 〇微米与300微米之间的范围内的内径，任选在约1. 0 微米与100微米之间；还任选在约1. 0微米与75微米之间；仍进一步任选在约1. 0微米与 50微米之间，仍进一步任选在约5. 0微米与50微米之间。
[0102] 在一些阵列中，阵列的开放区域包括多至90%的开放区域（0A)，这样当孔隙大小 在10 y m-500 y m之间变化时，每立方厘米阵列的微孔数目在458-1，146, 500之间变化，如 下表所示的。在一个阵列中，阵列的开放区域包括约67%的开放区域，这样当孔隙大小在 10 y m-500 y m之间变化时，每厘米阵列的微孔数目在341-853, 503之间变化，如下表所示 的。应理解，在孔隙大小为1 yrn以及开放区域多达90%时，每立方厘米阵列将容纳多达约 11，466, 000 个微孔。
[0103]
[0104] 在一个【具体实施方式】中，微孔阵列可通过粘合数亿硅石毛细管并经过热工艺将其 熔合在一起来制造。之后，割掉切片（〇.5_或更多），形成非常高纵横比的玻璃微型穿孔 阵列板。参见于2011年7月13日提交的国际申请PCT/EP2011/062015(W02012/007537)， 其通过参考以其整体并入本文。阵列也是商业可得的，诸如得自Hamamatsu Photonics K.K.，（Part No. J5022-19)以及其他制造商。在一些实施方式中，在一端封闭阵列的微孔， 且固体底物附着至阵列。
[0105] 因此，除了更快且更易于应用，检测所产生的蛋白质的能力使这种微孔阵列提供 了相比依赖于在展示载体（即，噬菌体展示、核糖体展示、哺乳动物细胞展示、细菌细胞展 示或酵母展示）表面上表达的靶分子的当前方法而言更高的分辨率。与噬菌体展示方法相 比，这种阵列的其他益处包括每孔同时测试两种（或更多种）靶分子的能力（即，正和负筛 选），以及不受限于被检查的担蛋白质的大小，这是因为噬菌体展示的蛋白质必须要小。 [0106] 在另一实施方式中，本发明考虑了加载阵列的方法，包括使含多个细胞的溶液与 阵列接触形成加载阵列。在一个实施方式中，将抗体分泌细胞（例如大肠杆菌）混合物均 匀加载到所有微孔中包括将500 y L液滴置于阵列的上侧并将其在所有微粒上铺展开。可 将异源细胞种群加载到微孔阵列上。在一个实施方式中，500 y L液滴中初始浓度约109个 细胞产生约3细胞（或亚群）/微孔。在一个实施方式中，每个微孔具有约20-80pL之间的 体积（取决于250 y m-lmm之间的玻璃毛细管板的厚度）。在加载微孔并放置过夜后，各微 孔然后应含有约2, 000-3, 000个细胞/微孔。在一个实施方式中，细胞可被培养多达58小 时而没有损失活力，从而最大化增殖率。尽管理解本发明的机制不是必需的，但是认为在全 部微孔上"铺展"液滴提供细胞在多个微孔中的最优分布。理论上，将液滴加至微孔阵列中 应当均匀地填充所有孔。然而，经验评价证实表面张力实际上阻止了该液滴进入中央的微 孔。如果液滴被均匀铺展在微孔阵列表面上，则将去除表面张力。因此，如果液滴被直接向 下放到微孔阵列上，由于表面张力仅有液滴边缘处的孔填充（此外，蒸发致液滴回缩，使得 液体不再保持处于悬浮）。这在检测适宜分析物后引发光环效应（halo ring effect)。见 W02012/007537〇
[0107] 在一个实施方式中，溶液占约三（3) yL。在一个实施方式中，所述多个细胞可选 自动物细胞、植物细胞和/或微生物细胞。在一个实施方式中，所述多个细胞包括大肠杆菌 (E.coli)细胞。在一个实施方式中，大肠杆菌细胞分泌至少一种感兴趣重组化合物。在一 个实施方式中，该感兴趣重组化合物对结合配体具有亲和性。
[0108] 尽管理解本发明的机制并非必要，但是认为如果在约500 yL溶液中存在约109个 细胞，则对于具有约3-4xl06微孔的阵列而言，平均起来应当存在约约三个（3)细胞/微孔。 应注意确切数目应取决于阵列中的孔数。例如，如果阵列具有约3-4xl0 6个微孔，其因此将 具有约500-100个细胞/孔。在一个实施方式中，每个微粒包括范围在约20-80pL之间的 体积。
[0109] 在某一实施方式中，腔的侧壁不能传输电磁辐射，或者腔涂覆有阻止电磁辐射在 阵列的腔之间传输的材料。合适的涂层应当不会干扰腔内的结合反应或者向腔施加力。示 例性涂层标记包括金、银和铂金的溅射纳米层。
[0110] 在一些实施方式中，阵列的腔具有能够自发将溶液吸收到孔中的亲水表面。
[0111] 样品稀释、制备和温育
[0112] 含生物样品种群和/或文库的样品在分配至阵列之前可能需要制备步骤。在一些 实施方式中，这些制备步骤包括温育时间。温育时间将取决于筛选的设计。示例时间包括 5分钟、1小时和/或3小时。示例范围为1秒至72小时。
[0113] 在某些实施方式中，在添加和/或加载到阵列上之前将生物元素的异源种群在培 养基中展开。对于某些应用，在指数生长期同时将培养基和元素混合物加载到阵列中。
[0114] 在其他实施方式中，含生物样品种群和/或文库的样品在添加至阵列之后可能需 要制备步骤。在其他实施方式中，在温育期间展开各孔的中各元素（生长细胞、繁殖噬菌 体、表达及释放蛋白质等）。该温育时间使生物元素产生生物活性分子。
[0115] 对于一些实施方式，各孔具有