品 包括来自环境（诸如土壤和水）的材料。生物样品可以是包括人类在内的动物、流体（例 如，血液、血浆和血清）、固体（例如，粪便）、组织、液态食品（例如，牛奶）和固态食品（例 如，蔬菜）。例如，肺样品可通过支气管肺泡灌洗（BAL)来收集，其包含源自肺组织的流体和 细胞。生物样品可包括细胞、组织提取物、体液、分离自细胞的同原染色体或染色体外元素、 基因组DNA、RNA、cDNA等。
[0046] 各实施方式描述
[0047] 公开了检测样品中的分析物的方法。该方法包括向具有确定检测表面的容器添加 含分析物的样品溶液、颗粒及发射电磁辐射。颗粒可由于施加于容器的力之故而积聚在检 测表面处并抑制信号自样品中的标记（可能附着于检测表面上积聚的颗粒的标记除外）发 出。样品中分析物的存在或缺乏控制着颗粒是否能够积聚在容器的检测表面和/或可能结 合于表面上的颗粒的标记是否能够发射电磁辐射。本发明可用于本领域已知的的多种测定 形式。
[0048] 在一个方面，标记结合于颗粒，或者作为样品在分析物存在或缺乏的结果，标记变 成结合于颗粒。按照本公开的这种实施方式，颗粒可以用结合分析物的结合配体功能化，其 可用本领域技术人员熟知的测定形式来分析，例如，夹心法和竞争免疫测定法。在夹心法 中，将颗粒用分析物的结合配体功能化并与标记相混合，该标记包括能够发射信号的部分 (例如，荧光部分）和分析物的结合配体。作为分析物与颗粒和标记结合的结果，标记变成 与颗粒结合。标记在颗粒上的存在表明样品中分析物的存在。在竞争性检测形式中，使具 有分析物结合配体的颗粒以及包括作为分析物类似物的第二结合配体的标记与样品混合。 该类似物与样品中的分析物相竞争地结合于颗粒上的分析物的结合配体。来自标记的信号 的缺乏表明样品中分析物的存在。
[0049] 在另一测定形式中，分析物是酶，而颗粒直接用充当标记的该酶的底物官能化 (例如，通过共价键合），或者该酶作为特异性或非特异性结合或其他相互作用的结果与所 述颗粒结合。来自酶/标记的信号的存在或缺乏指示了分析物/酶将标记从产生信号转化 至无信号产生（反之亦然）的活性。
[0050] 另一测试形式利用分析物释放与颗粒结合的标记的能力。例如，分析物可以是裂 解标记与颗粒之间的连接体的酶。或者，分析物当存在于样品中时可阻止连接体裂解以及 标记自颗粒中释放。
[0051] 在使结合或酶反应进行之后，使颗粒积聚于检测表面处，以便部分或完全抑制电 磁辐射经过该表面而传播到样品中及从中传播出来。然后测定该检测表面处电磁辐射的存 在或其量。因此，当颗粒积聚于该表面时，可在该表面处检测来自附着至颗粒的标记的电磁 辐射。但是，所述颗粒在表面处充当遮蔽物，以便抑制来自未结合于颗粒的标记的电磁辐 射。因此，消除了样品中的未结合标记的背景信号。类似地，当颗粒不含任何结合标记时， 该颗粒将不会在检测表面处发生任何电磁辐射，并且其充当遮蔽物，以便抑制来自样品溶 液中的未结合标记在表面处被检测到。
[0052] 在另一实施方式中，反应容器包括位于容器壁上的结合配体。在作为分析物存在 或缺乏之故的结合反应中，颗粒被捕获或者未被捕获在反应容器的表面上。然后，颗粒没有 抑制来自样品中的标记的电磁辐射经过检测表面传播出反应容器。在该实施方式中，标记 无需参与结合反应并且能够在溶液中保持未结合。结合反应控制着当力施加于该反应容器 时颗粒积聚在检测表面上的能力。在该实施方式中，当颗粒及容器壁涂覆有分析物的结合 配体时，在分析物存在情况下，颗粒可变成结合于溶液的表面，其中分析物被夹在结合配体 之间。在该实施方式中，来自反应容器中的标记的信号表明分析物的存在，这是因为颗粒变 得结合于反应容器的壁，而且不能抑制电磁辐射离开容器。在竞争性测定方式中，在分析物 缺乏的情况下，涂覆有分析物类似物的颗粒将与涂覆有分析物结合配体的容器壁结合。因 此，自容器中信号的缺乏将表明存在着分析物。
[0053] 当标记可通过外源激活时，例如通过电磁辐射可激发的荧光标记，积聚于表面的 颗粒将阻止电磁辐射激发结合于表面处的颗粒的标记除外的任何标记。检测表面处的颗粒 充当阻止电磁辐射进入样品溶液并激发溶液中未结合标记的遮蔽物。因此，仅有附着至表 面处的颗粒的标记被激发，并且避免了来自未结合标记的背景信号。当标记通过电磁辐射 (例如，热、电、化学反应、酶促反应）之外的来源可激活时，来自样品中的激活标记的电磁 辐射被阻止经过检测表面离开容器，这是由于积聚在检测表面的颗粒之故。
[0054] 反应容器的尺寸仅受限于颗粒积聚在该容器的反应表面并部分或完全抑制电磁 辐射传播进入或离开该容器的能力。优选较小形式，因为较小样品尺寸是以有效方式筛选 多种生物元素所必需的。
[0055] 适用于本发明的反应容器已经或者能够被构造成具有能否积聚官能化颗粒的检 测表面。该表面不限于特定材料，只要其能传递电磁辐射即可。可选地，该表面不结合任何 材料，而且可对环境开放，使得该检测表面成为样品溶液的表面，例如，反应孔、微孔板、微 孔、毛细管或微腔中的样品溶液的弯液面。电磁辐射经过该表面的传播应当不受阻碍，当颗 粒积聚在该表面时除外。在大规模上，该表面可以是试管或反应孔中的窗口。无论容器尺 寸如何，该表面周围的面积应阻止电磁辐射传播进入样品或离开样品，以使电磁辐射仅能 经过该表面进入样品中。反应容器可具有不止一个表面，例如诸如位于毛细管或微管各开 口端的多个窗口或弯液面。
[0056] 颗粒在检测表面上的积聚可通过向样品施加力来实现，该力将颗粒牵引至表面。 该力应当足够，以使颗粒的积聚阻止至少50%的电磁辐射经过该积聚颗粒。在具体实施方 式中，当至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%的辐射被阻止经表面 进入或离开样品时，抑制电磁辐射经检测表面进入或离开样品。可用于使颗粒积聚于检测 表面的力的示例性类型包括重力、磁力、电力、离心、力、对流力和声学力。
[0057] 重力可用于使颗粒沉降至反应容器的底部。当容器底部包括检测表面时，来自与 颗粒缔合的标记的信号可被检测到。施加于含磁性颗粒的样品的磁力可用于将颗粒吸引至 容器顶部或其他部位的检测表面。在特定实施方式中，磁力通过磁铁来施加，例如，立方体 钦磁铁（B666, K&J Magnetics Inc.)。
[0058] 类似地，可使用带电颗粒，受电力作用，其使颗粒贯穿样品移动并朝向检测表面。 在一些实施方式中，所述力是如美国专利申请第2006/0078998号中所述的电动力，该专利 申请通过参考以其整体引入本文。在一些实施方式中，颗粒绝缘并抑制电力施用于样品，从 而阻止样品中电刺激标记的激活。
[0059] 同样，可使用具有不同共振频率的不同形状的颗粒经历声波频率，其将共振颗粒 转移并积聚于声压节点。在一些实施方式中，该力是例如在Laurell, T.，et al.，Chem. Soc. Rev. 2007, 36:492-506中描述的声学力，该文献通过参考以其整体并入本文。
[0060] 图1描绘了微孔阵列中的示例性抗原-抗体识别测定或"夹心"分析法。在该实 施方式中，颗粒是磁性微粒且与抗原缔合和/或结合。所描述的分析物是通过样品中的细 胞生产的靶蛋白。荧光标记与抗体缔合或结合，该抗体对所述靶蛋白具有特异性和/或与 其结合。图（A)是将任何力施加于阵列之前一个或多个孔中存在的各种生物组分的示意 图。由于结合于靶蛋白的抗原，所述颗粒与荧光标记缔合，该靶蛋白也与经标记抗体结合。 图（A)表示样品添加至孔中之后不久的时间点，这是因为一些靶蛋白保持着未与抗原和/ 或抗体结合。在一些实施方式中，然后将阵列温育和/或搅拌，以促进靶蛋白结合。在任选 的温育之后，图（B)描绘了通过施加磁力而使颗粒积聚于检测表面后的孔。在该实施方式 中，检测表面是孔中的液体的开放表面。在该实例中，从孔表面检测到来自与磁性颗粒结合 的标记的电磁（EM)信号。
[0061] 在另外的实施方式中，提供了检测样品中的两种或更多种分析物的方法。该方法 包括向反应容器中添加发射电磁辐射的第二标记和基于下述性能中至少一种而不同于所 述第一颗粒的第二颗粒：形状、尺寸、密度、磁导率、电荷及光学涂层。如上所述，第二标记与 第二颗粒结合，或者作为样品中第二分析物存在或缺乏的结果（例如，酶与颗粒结合，或者 作为竞争性测定或夹心测定的结果，标记变成结合的），该第二标记变成与第二颗粒结合。 第二颗粒积聚在第二检测表面处，以抑制电磁辐射经由该第二检测表面传播进入样品中以 及从中传播出来。在该第二检测表面处检测由第二颗粒发出的电磁辐射的存在或量。
[0062] 在各种实施方式中，用于检测第一分析物的第一颗粒由于第一力而积聚于第一检 测表面处，而第二颗粒由于第二力而积聚于第二检测表面处，其中第一力和第二力独立选 自重力、磁力、电力、离心力、对流力和声学力，如上所述。第一力和第二力被同时或顺序施 加于样品并完成检测。
[0063] 颗粒
[0064]当颗粒具有遮蔽样品（例如，抑制来自溶液中荧光色素的激发能以及背景信号向 检测器的传播）能力时，通过将颗粒集中于检测表面处实现高灵敏度。合适的颗粒很容易 商业可得的，并且根据本文公开的方法可使用各种颗粒，只要所述颗粒能够积聚并抑制电 磁辐射经过检测表面。在各种实施方式中，颗粒是部分或完全不透明的。在某些实施方式 中，颗粒稀释电磁辐射，例如，颗粒可以具有至少约10 %的吸收效率，例如，25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100%。
[0065] 在各种实施方式中，颗粒的大小从纳米级至反应容器横截面大小的三分之一。例 如，当微腔直径为约20微米时，颗粒可基于约0. 01-7微米的直径。颗粒的大小应允许颗粒 积聚在容器的检测表面处，使得颗粒的积聚抑制电磁辐射进入或离开样品溶液。例如，当反 应容器是微孔时，样品溶液与微孔的壁形成弯液面。当微孔在两端敞开时，弯液面形成于微 孔的顶部和底部。颗粒应当能够积聚在微孔顶部和底部的弯液面处，使得电磁辐射被阻止 离开或进入微孔中的样品溶液。
[0066] 在特定实施方式中，颗粒直径在约0. 01微米至约50微米范围内，这取决于所用的 容器的尺寸。在各种实施方式中，颗粒尺寸范围为约〇. 1-15微米、约0. 5-10微米以及约1 至约5微米。
[0067] 在某些实施方式中，颗粒包含金属或碳。适宜金属的非限定性实例包括金、银和 铜。其他金属材料适用于结合测定，这是本领域技术人员熟知的。
[0068] 在一个实施方式中，颗粒具有磁性，以使磁力可用于将颗粒积聚于各反应容器的 检测表面上，例如微腔的弯液面。
[0069] 可对颗粒的表面化学功能化，以提供与样品组分的结合，这是本领域技术人员熟 知的。例如，使颗粒与链霉亲和素、生物素、寡聚（dT)、蛋白质A&G、标记蛋白和/或任何其 他链接多肽偶联。在大量应用中利用了链霉亲和素-生物素相互作用的非常高的结合亲和 性。结合链霉亲和素的颗粒将于生物素化核酸、抗体或其他生物素化配体和靶标结合。生 物素化抗原是可与用于筛选分析物的颗粒结合的产物的有用实例。在【具体实施方式】中，颗 粒为偶联于若干不同配体的DYANABEAD?颗粒（Invitrogen, Carlsbad, CA)，例如，寡 聚（(^)、蛋白质六&6、标记蛋白（把8^1^6)、二次抗体和/或链霉亲和素（?&竹此.112-0? ,Invitrogen, Carlsbad, CA)〇
[0070] 在一些实施方式中，具有不同磁导率的颗粒可用于提供作用于颗粒的磁力的独立 控制。在其他实施方式中，颗粒的其他性能可用于扩展在每个腔中进行的测定的复用能力。 当添加至样品中时，颗粒与所需靶标（细胞、病原微生物、核酸、肽、蛋白质或蛋白质复合物 等）结合。这种相互作用有赖于颗粒表面上的配体的特异性亲和力。或者，可将与酶的底 物缀合的颗粒添加至样品，在这种情况下样品中的酶/分析物终止底物发荧光的能力或者 将底物激活成荧光的（例如，底物的酶介导裂解）。
[0071] 另一实施方式利用具有不同形状、密度、尺寸、电荷、磁导率或光学涂层的磁性颗 粒。这允许将不同探针（即结合配体）采用不同颗粒，并且通过调整如何或何时施加磁场 或其他力，所述颗粒可被单独探测。还可利用沉降率通过尺寸、形状和密度来分离颗粒并扩 展各腔中进行的测定的复用能力。
[0072] 例如，一个颗粒能够含有将允许测定每个腔中所产生的抗体与靶标的亲和性的靶 标抗原。位于各腔中的另一颗粒可含有位于同一颗粒上的多种抗原，其允许测量抗体的特 异性。当没有磁场时，可以利用具有不同尺寸或密度的颗粒的沉降时间。可通过在腔底部 扫描检测表面来检测具有较快沉降时间的颗粒。如果具有较慢沉降时间的颗粒具有较高磁 导率，则仅仅当施加磁场时其能够在其他颗粒之前被吸引至腔的底部。
[0073] 类似地，一些颗粒可以是磁性的，而其他则不是，并且磁性颗粒可以通过施加的磁 场被吸引至腔的顶部并在那里得到检测，而无磁性颗粒沉降至腔的底部并能够在那里的得 到检测。利用这些类型的方法，可以在同一孔中测量灵敏度和特异性。
[0074] 在某些实施方式中，颗粒用于混合容器中的内含物。例如，在温育步骤中，使磁性 颗粒交替或间歇地经历磁场。颗粒的运动和沉降导致反应容器中的内含物混合。
[0075] 可使用任何合适的结合配体，其对待被检测的分子（例如，标记物）形式具有必需 的特异性。如果分子（例如标记物）具有数种不同形式，则结合配体的不同特异性是可能 的。适宜的结合配体在本领域是已知的且包括抗体、适体、外源凝集素和受体。有用且通用 的结合配体类型是抗体。
[0076] 本文公开的检测样品中的分析物的方法允许同时测试每个孔中的两种或更多种 不同抗原。因此，在一些实施方式中，同时的正和负筛选可发生于同一孔中。这种筛选设计 改进了初始采样数的选择性。在某些实施方式中，所测试的第二抗原可以是对照抗原。利用 对照抗原对贯穿阵列中的多个孔归一化生物元素浓度是有用的。非限定性实例将是利用对 感兴趣分析物具有特异性的第一抗原以及对所有蛋白质具有非特异性的第二抗原，诸如_ N或-C端。因此，感兴趣孔的结果可通过使信号与总蛋白质浓度进行比较来量化。
[0077] 在一些实施方式中，第二抗原与不同于第一颗粒的第二颗粒缔合。所述颗