含量的测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于化学发光技术领域，具体为一种Pb2+含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 随着金属制品、汽油、蓄电池、化学涂料等产品使用量的不断增加以及工农业三废 的排放，铅以多种途径广泛进入到人们的生活环境中，并呈加剧趋势，不仅直接影响农作物 的生长发育、产量、品质等，而且间接通过食物链对人体健康造成严重的危害，铅污染已经 引起了广泛关注。传统的重金属铅检测技术已经难以满足环境与食品安全监控的需求，因 此，建立方便、快速的重金属铅的检测技术十分必要。
[0003] 目前测定Pb2+的传统方法灵敏度不高，操作复杂，不容易满足实际检测要求。常 用的铅的检测方法有原子吸收光谱法（李宏卫，曹建劲，苏志华，等.铅检测方法研究进展 [J].安徽农业科学，2008, 36 (19) :8255~8256,8262);分子信标核酸检测技术（毛华伟， 赵晓东，杨锡强.脱氧核酶研究进展[J].中国生物工程杂志，2003, 23(4) :43~47)，化 学发光法（Xiang Li, Gongke Wang, Xuelian Ding, Yuhan Chen, Yaping Gou and Yan Lu. A turn-〇n fluorescent sensor for detection of Pb2+based on graphene oxide and G-quadruplex DNA. Phys. Chem. Chem. Phys, 2013, 15, 12800-12804)。这些方法各有其优点， 能不同程度的满足对Pb2+的检测要求，但方法的灵敏度不高、操作复杂。所以必须发展一种 灵敏度高，简单的新型检测方法。
【发明内容】
[0004] 鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种Pb2+含量的测定方法。
[0005] 本发明是通过以下措施来实现的：
[0006] (1)利用链霉亲和素与生物素的作用将生物素修饰的DNAl与链霉亲和素修饰磁 珠进行交联制备发卡DNAl修饰磁珠 DNAl-MB ;
[0007] ⑵利用Pb2+可以诱导富G寡核苷酸链形成G四链体结构的特征，当含Pb 2+样品 加入DNAl-MB中后，富G寡核苷酸链形成G四链体结构；然后，加入标记探针DNA2后，DNA2 的5'端与G四链体结构3'端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA2未杂交的 部分与G四链体未杂交部分继续进行杂交反应，形成双链DNA，将DNA2附着在磁珠上，同时， 将Pb2+替换下来，被替换下来的Pb 2+进行下一个G四链体结构的形成，并使另外一条DNA2 附着在磁珠上，如此Pb2+被循环利用，同时将大量的DNA2附着在磁珠上，利用光二极管诱导 化学发光原理，利用化学发光仪检测化学发光强度，根据化学发光强度实现对Pb2+的测定。
[0008] 本发明所建立的一种Pb2+含量的测定方法，其特征是：
[0009] 当含Pb2+样品加入后，发卡结构被打开，生成Pb 2+_G四链体的稳定结构。然后，加 入标记探针DNA2后，DNA2与G四链体末端的足点域杂交，Pb2+-G四链体结构被破坏，打开 G四链体，释放出Pb2+。使Pb2+能与未反应的发卡DNAl作用，使得Pb 2+循环利用，将更多的 标记探针DNA2杂交于磁珠表面。通过光二极管诱导化学发光过检测化学发光信号，从而实 现Pb2+含量的测定。以Pb2+浓度为横坐标，化学发光信号强度为纵坐标，绘制标准曲线；测 定未知样品的化学发光信号强度，根据标准曲线得到样品中Pb2+的含量，从而实现对Pb2+进 行定量测定。
[0010] 本发明研制Pb2+测定方法具有如下特点：
[0011] 在足点域杂交作用下，DNA2与G四链体碱基配对，同FITC标记的碱基序列与生成 的Pb2+-G四链体末端的足点域杂交，Pb2+-G四链体结构被破坏，打开G四链体，释放出Pb 2+的原理，再根据光二极管诱导化学发光建立了一种化学发光测定Pb2+的方法。
[0012] 只需要两条DNA链就建立了 Pb2+的测定方法，这种设计有着简单、快速的优势。另 外，根据实验化学发光信号（图3)可以看出，当本发明的方法用于检测Fe2+、Fe3+、Mn 2+、Ni2+、 Hg2+Ag+、Cd2+和Cu 2+时，其发光强度远远低于检测Pb 2+的化学发光信号，说明该方法具有很 高的选择性来检测Pb2+。因此，本发明涉及的方法在构建检测Pb2+的研究方法中体现出良 好的发展前景。
[0013] 具体步骤为：
[0014] a磁珠的前期处理。取10 yL链霉亲和素修饰的磁珠至ImL离心管中，并用100 yL pH8. 0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍；
[0015] b发卡DNA的预处理。发卡DNA在使用之前在95 °C孵化2min，并逐步降至室温备 用；
[0016] c发卡DNAl在磁珠表面的固定。将100 μ L pH 6. 8的磷酸缓冲溶液加入到盛有 10 μ L磁珠的ImL离心管中，并加入10 μ L 1. 00 X 10 5M生物素修饰的发卡DNAl链，在37°C 下振荡反应30min，得发卡DNAl修饰的磁珠，并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100 μ L 的磷酸缓冲溶液中；
[0017] d Pb2+含量的测定。再加入含Pb2+样品，DNAl的发卡结构被打开，并生成Pb2+-G四 链体的稳定结构，再加入标记探针DNA2链后，在足点域作用下，DNA2与G四链体碱基配对， Pb2+-G四链体结构被破坏，打开G四链体，释放出Pb2+，使Pb2+再与未反应的发卡DNAl作用， 使得Pb2+循环利用，同时标记探针DNA2留在磁珠上，通过光二极管诱导化学发光过检测化 学发光信号，从而实现Pb2+含量的测定。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明的实验原理图。
[0019] 图2为Pb2+的标准曲线。
[0020] 图3为检测方法选择性实验结果。
【具体实施方式】
[0021] 以下是本发明涉及的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本 发明的保护范围并不限于这些实施例。凡不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本 发明的保护范围之内。
[0022] 本发明涉及的一种检测Pb2+的化学发光传感器，将链霉亲和素修饰磁珠，以其为 捕获载体，捕获发卡DNAl ;用FITC标记DNA2为标记探针。当含Pb2+样品加入DNAl修饰的 磁珠溶液时，形成Pb2+-G四链体结构。然后加入标记探针，标记探针与G四链体结合；利用 磁分离技术，取磁性分离物，并分散于磷酸缓冲溶液中；该溶液在光二极管诱导下产生化学 发光。
[0023] 本发明是通过以下措施来实现的：一种检测Pb2+的制备方法，包括以下步骤：
[0024] (1)磁珠的前期处理：
[0025] 所述磁珠处理，优选的，利用生物素与链霉亲和素作用将生物素修饰的DNAl与磁 珠进彳丁反应制备了 DNAI-MB。具体过程如下：
[0026] (a)取10 μ L链霉亲和素修饰的磁珠至ImL离心管中，在8000r/min条件下离心 10分钟。
[0027] (b)用100 μ L pH 8. 0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散到100 μ L的 Tris-HCl缓冲溶液中。
[0028] (2)发卡DNA的预处理：
[0029] 优选的，实验中的发卡DNA在使用之前在95°C下孵化2min，然后，逐步降温至室 温。
[0030] (3)发卡DNAl在磁珠表面的固定：
[0031] 优选的，将100 μ L pH 6. 8的磷酸缓冲溶液加入到盛有10 μ L的磁珠溶液中，并加 入10 μ L 1.0 X 10 5M的生物素修饰的发卡DNAl，在3