7°C下振荡反应30min，得发卡DNAl修 饰的磁珠，用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100 μ L磷酸缓冲溶液中。
[0032] (4) Pb2+的检测：
[0033] 优选的，将100 μ L含有Pb2+的样品溶液加入到100 μ L发卡DNAl修饰的磁珠中。 37°C下震荡反应30分钟。然后，加入100 μ L 1.0 X 10 5M的FITC标记的DNA2溶液，37°C下 震荡4小时，然后磁性分离，弃去清液，将磁珠用磷酸缓冲溶液洗涤两次，然后将所得磁珠 分散于100 μ L磷酸缓冲溶液中。取200 μ L pH 11. 3,浓度为0.0 lM的鲁米诺溶液于小烧杯 中，并加入上述所得的50 μ L磁珠溶液。打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，然后测 定化学发光强度，根据化学发光强度实现刀Pb2+的测定。
[0034] 实施例：一种Pb2+含量的测定方法
[0035] L实验部分
[0036] I. 1仪器与试剂
[0037] IFFM-E型流动注射化学发光分析仪（西安瑞迈分析仪器有限公司）；ΤΗΖ-82Α气 浴恒温振荡器（全坛市医疗仪器厂）。
[0038] 化学发光试剂鲁米诺购自阿拉丁试剂公司；链霉亲和素修饰磁珠（优选的，直径 2~3 μπι)购自天津倍思乐色谱技术开发中心；
[0039] 所用人工合成DNA序列（购自北京赛百盛生物工程有限公司）如下。
[0040] 所述的DNA的部分序列为：
[0041] DNAl :5' -biotin-ATCCGATCGGATACCCGGGTGGGTGGGTGGGTATCCGA-3'。
[0042] DNA2 :5-TCGGATACCCACCCACCCACCCG-FITC-3，。
[0043] I. 2实验步骤
[0044] I. 2. 1磁珠的前期处理：
[0045] 将生物素修饰的DNAl与磁珠进行反应制备DNAl-MB。具体过程如下：（a)取 10 μ L链霉亲和素修饰的磁珠至ImL离心管中，8000r/min离心。（b)用100 μ L pH 8. 0的 Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散到100 μ L的Tris-HCl缓冲溶液中。
[0046] 1. 2. 2发卡DNA的预处理：
[0047] 实验中的发卡DNA在使用之前在95°C下孵化2min，然后，逐步降温至室温。
[0048] 1. 2. 3发卡DNAl在磁珠表面的固定：
[0049] 将100 μ L pH 6. 8的磷酸缓冲溶液加入到盛有10 μ L的磁珠溶液中，并加入10 μ L I. 0 X 10 5M的生物素修饰的发卡DNAl，在37°C下振荡反应30min，得发卡DNAl修饰的磁珠， 用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100 μ L磷酸缓冲溶液中。
[0050] I. 2. 4Pb2+的检测：
[0051] 将100 μ L含有Pb2+的样品溶液加入到100 μ L发卡DNAl修饰的磁珠中。37°C下 震荡反应30分钟。然后，加入IOOyL 1.0X10 5M的FITC标记的DNA2溶液，37°C下震荡 4小时，然后磁性分离，弃去清液，将磁珠用磷酸缓冲溶液洗涤两次，然后将所得磁珠分散于 100 μ L磷酸缓冲溶液中。取200 μ L pH 11. 3,浓度为0.0 lM的鲁米诺溶液于小烧杯中，并 加入上述所得的50 μ L磁珠溶液。打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，然后测定化 学发光强度，根据化学发光强度实现刀Pb2+的测定。
[0052] L 3结果与讨论
[0053] 在优选的条件下，不同浓度Pb2+与化学发光信号之间成一定线性关系，得到了检 测Pb2+的标准曲线、线性范围及线性方程。当Pb2+的浓度在1.0X10 1(]~1.0X10 7M之 间时，体系的化学发光信号随着Pb2+浓度的增大而增大（图2)。线性回归方程为I a = 67. 437C - 31. 965 (1为体系的化学发光信号；C为Pb 2+的浓度，IOnM ;n = 7, R = 0. 9979)。 该方法检测限为3. OX 10 nM。对浓度5. OX 10 9M的Pb2+进行7次平行重复测定的RSD为 4. 2%，表明本法有较好的重现性。
[0054] 选择？62>63+、1112+、附 2+、取2、+、0(12+和〇12+作为检测方法对？13 2+检测的对比物。如 图 3所示：将方法检测浓度为 2. OX 10 8M Pb2+，以及 L OX 10 5M Fe2+、Fe3+、Mn2+、Ni2+、Hg 2+Ag+、 Cd2+和Cu2+，并将化学发光信号进行比较。可以看出，检测Fe2+、Fe 3+、Mn2+、Ni2+、Hg2+Ag+、Cd 2+和Cu2+的化学发光信号远远低于检测Pb 2+的化学发光信号（图3)，说明该化学发光适体传 感器具有足够高的选择性来测Pb2+。
[0055] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、代替、组合、简化，较 为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种Pb2+含量的测定方法，其特征是包括以下步骤： I. 1磁珠的前期处理，取IOy L链霉亲和素修饰的磁珠至ImL离心管中，并用IOOy L pH 8. 0的Tris-HCl缓冲溶液清洗两遍； 1. 2发卡DNA的预处理，发卡DNA在使用之前在95 °C孵化2min，并逐步降至室温备用； 1.3发卡DNAl在磁珠表面的固定，将IOOy L pH 6. 8的磷酸缓冲溶液加入到盛有IOy L 磁珠的ImL离心管中，并加入10 y L 1.0 OX 10 5M生物素修饰的发卡DNAl链，在37°C下振 荡反应30min，得发卡DNAl修饰的磁珠，并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100 y L的 磷酸缓冲溶液中；再加入含Pb2+样品，DNAl的发卡结构被打开，并生成Pb2+-G四链体的稳定 结构，再加入标记探针DNA2链后，在足点域作用下，DNA2与G四链体碱基配对，Pb 2+-G四链 体结构被破坏，打开G四链体，释放出Pb2+，使Pb2+再与未反应的发卡DNAl作用，使得Pb 2+ 循环利用，同时标记探针DNA2留在磁珠上，通过光二极管诱导化学发光过检测化学发光信 号，从而实现Pb2+含量的测定。2. 根据权利要求1的一种Pb 2+含量的测定方法，其特征为所述的DNA部分序列为： DNAl :5' -biotin-ATCCGATCGGATACCCGGGTGGGTGGGTGGGTATCCGA-3' ； DNA2 :5' -TCGGATACCCACCCACCCACCCG-FITC-3'。
【专利摘要】一种Pb2+含量的测定方法，属于化学发光技术领域，利用末端含富G寡核苷酸链的发卡DNA1修饰磁珠制备DNA1修饰磁珠DNA1-MB，当含Pb2+样品加入DNA1-MB中后，形成Pb2+-G四链体结构；再加入DNA2后，DNA2的5’端与G四链体结构3’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA2未杂交的部分与G四链体未杂交部分继续进行杂交形成双链DNA，将Pb2+替换下来进行下一个G四链体结构的形成，如此Pb2+被循环利用，同时将大量的DNA2附着在磁珠上，利用光二极管诱导化学发光原理，利用化学发光仪检测化学发光强度，根据化学发光强度实现对Pb2+的测定。本发明方法简单、成本低、灵敏度高。
【IPC分类】G01N21/76
【公开号】CN105044081
【申请号】CN201510325760
【发明人】混旭, 张金海
【申请人】青岛科技大学
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年6月12日